SIRT1基因敲除加速小鼠椎间盘退变的实验研究

发布时间：2020-10-02 11:13

　　目的:椎间盘退变是诱发腰背痛最主要的原因之一,关于椎间盘退变发生、发展的机制尚未明确。近年来,研究发现SIRT1基因具有调节机体代谢、延长寿命及控制细胞分化和再生等多个生物学效应,并在骨关节炎中起着重要作用。但SIRT1在椎间盘退变中的作用机制及功能尚未明确。因此,本项目我们将建立软骨特异性敲除SIRT1基因小鼠的动物模型,并通过刺针在小鼠尾椎椎间盘建立急性椎间盘退变模型,来探讨SIRT1在该退变中的作用和相关机理,从而为椎间盘退变的防治提供新的思路。方法:1、建立软骨特异性敲除SIRT1基因小鼠的动物模型,通过基因工程小鼠繁殖出SIRT1~(+/+)小鼠。在小鼠出生后6周,将其随机分为两组(每组10只),将其中一组按75mg/kg的标准腹腔注射10mg/ml的他莫昔芬(每天1次,连续5天),来特异性敲除软骨中的SIRT1基因,另一组小鼠未进行任何处理。注射1周后,取两组小鼠尾尖行荧光定量PCR和普通PCR加电泳,以及椎间盘组织中SIRT1蛋白表达的免疫组化,以鉴定软骨组织中SIRT1基因的敲除情况。2、通过对SIRT1~(+/+)、SIRT1~(-/-)两组小鼠尾椎椎间盘进行针刺来建立急性椎间盘退变模型,在术后第2、4、6及8W行X线拍片观察椎间高度和测量椎间高度指数(Dise Height Index,DHI)的改变情况。同时分别在术后4W、8W各处死两组小鼠各5只,取两组小鼠尾椎组织标本行HE染色、甲苯胺蓝染色、Masson染色及潘红O染色,并对椎间盘组织中I型胶原、II型胶原及AGC进行免疫组化观察,比较SIRT1基因敲除组与未敲组小鼠椎间盘的退变情况。3、为进一步探讨软骨特异性敲除SIRT1基因对椎间盘退变的影响机制,本研究还对两组小鼠尾椎进行了Micro-CT扫描,量化椎体骨量体积百分比、骨小梁的数目、骨小梁的厚度和三维结构的改变。结果:1、SIRT1基因敲除组小鼠大体观和体重与未敲组无明显差异,饮食活动正常。通过荧光PCR结果显示,SIRT1基因敲除组小鼠尾尖软骨组织中SIRT1mRNA表达量显著低于未敲除组小鼠(P0.05);SIRT1免疫组化结果显示,椎间盘组织中SIRT1蛋白免疫组化染色积分SIRT1基因敲除组小鼠显著低于未敲除组(P0.01),说明成功建立软骨特异性SIRT1基因敲除动物模型。2、影像学结果显示,在两组小鼠中,穿刺组的DHI%均显著低于不穿刺组(P0.05);在穿刺条件下,SIRT1基因敲除组小鼠的DHI%显著低于未敲除组(P0.05);在不穿刺条件下,SIRT1基因敲除组小鼠的DHI%也显著低于未敲组(P0.05)。结果证明穿刺加速小鼠椎间高度的降低;在穿刺或不穿刺条件下,软骨特异性敲除SIRT1基因敲除均能加速椎间高度的降低。3、椎间盘组织学评分结果显示:在4W时,SIRT1基因未敲组小鼠中穿刺组评分显著高于不穿刺组(P0.01);SIRT1基因敲除组小鼠中穿刺组评分也显著高于不穿刺组(P0.05);在穿刺条件下,SIRT1基因敲除组小鼠评分显著高于未敲除组(P0.05);在不穿刺条件下,SIRT1基因敲除组小鼠评分显著高于未敲除组(P0.01)。在8W时,两组小鼠中穿刺组评分均显著高于不穿刺组(P0.01);在穿刺条件下,SIRT1基因敲除组小鼠评分显著高于未敲除组(P0.05);在不穿刺条件下,SIRT1基因敲除组小鼠评分也显著高于未敲除组(P0.01)。结果证实,穿刺能增加椎间盘组织学评分;在穿刺或不穿刺条件下,软骨特异性敲除SIRT1基因均能增加椎间盘组织学评分。4、免疫组化积分结果显示,在术后4W和8W时SIRT1基因敲除组小鼠的穿刺组和不穿刺组椎间盘髓核组织中II型胶原及AGC的免疫组化染色积分均显著低于SIRT1基因未敲除组(P0.05);在术后4W和8W时SIRT1基因敲除组小鼠穿刺组和不穿刺组尾椎的椎间盘纤维环中的I胶原的免疫组化染色积分均高于SIRT1基因未敲除组,但仅在术后8W时存在显著差异(P0.05)。结果证实,穿刺降低小鼠椎间盘中II型胶原、AGC的表达,同时增加I胶原的表达;在穿刺或不穿刺条件下,软骨特异性敲除SIRT1基因均能降低小鼠椎间盘中II型胶原、AGC的表达,同时增加I胶原的表达。5、Micro-CT结果显示:SIRT1基因敲除组骨量体积百分比显著高于未敲除组(P0.05);SIRT1基因敲除组骨小梁数目显著高于未敲除组(P0.05);两组骨小梁厚度相互比较无统计学差异(P0.05)。结论:通过本研究测量DHI%、观察椎间盘组织评分、计算免疫组化染色积分及Micro-CT的实验结果证实:1、穿刺能加速小鼠椎间盘退变;2、在穿刺条件下软骨特异性敲除SIRT1基因加速小鼠椎间盘退变;3、在不穿刺条件下软骨特异性敲除SIRT1基因同样也能加速小鼠椎间盘退变;4、软骨特异性敲除SIRT1基因加速小鼠椎间盘退变的可能机制是增加椎体骨小梁数目和骨密度。本实验通过利用软骨特异性敲除SIRT1基因小鼠建立椎间盘急性退变模型,证明了软骨特异性敲除SIRT1基因加速小鼠椎间盘退变,为今后研究椎间盘退变的防治,提供一种新的思路。
【学位单位】：广州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R681.53
【部分图文】：

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图 3. SIRT1 基因小鼠繁殖及分组3、软骨特异性敲除 SIRT1 基因小鼠出生后 6 周，随机取 10 只 SIRT1+/+小鼠按 75mg/kg 体重标准腹腔注射10mg/ml 他莫昔芬，每日 1 次，连续注射 5 天，来敲除软骨组织中 SIRT1 基因，建立 SIRT1 基因敲除组。4、实验分组SIRT1 基因未敲除（SIRT1+/+）小鼠动物模型组（n=10）；SIRT1 基因敲除（SIRT1-/-）小鼠动物模型组（n=10）。5、软骨特异性敲除 SIRT1 基因的鉴定5．1 查询软骨特异性敲除 SIRT1 基因表型

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结果结果1、软骨特异性敲除 SIRT1 基因的鉴定结果结果显示SIRT1基因未敲除组小鼠SIRT1mRNA表达量为8.08257±1.63958，SIRT1 基因敲除组小鼠 SIRT1 mRNA 表达量为 2.60867±1.11480，差异有统计学意义(P<0.01)。普通 PCR 的 DNA 琼脂糖凝胶电泳结果（图 4）证实 SIRT1 基因敲除组小鼠椎间盘软骨终板中 SITR1 基因敲除成功。

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图 5.椎间盘髓核组织免疫组化中 SIRT1 的表达情况，标尺=50um。A 与 B 为 SIRT1-/-小鼠椎间盘退变模型组中 4W 与 8W 组髓核组织中 SIRT1 的表达情；C 与 D 为 SIRT1+/+小鼠椎间盘退变模型组中 4W 与 8W 组髓核组织中 SIRT1 的表达情况。注：黑色箭头为阳性细胞。

【参考文献】