PTBP1对乳腺癌细胞生长和侵袭转移的影响

发布时间：2020-10-08 23:46

　　目的:乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。全世界每年约有l 200 000妇女发生乳腺癌,500000妇女因乳腺癌死亡。北美和欧洲等发达国家是乳腺癌的高发区。据统计,美国妇女9个人中将有1人在其一生中患乳腺癌。亚洲是乳腺癌的低发区,但乳腺癌的发病率逐年升高,且有年轻化趋向。PTBP1属于heterogeneous nuclear ribonucleoproteins(hnRNPs)家族成员,可在RNA代谢的许多方面发挥多种功能。PTBP1对于调控可变剪接、IRES介导的翻译起始以及提高多种转录本的稳定性都是至关重要的。PTBP1细胞定位和它与多种因子的相互作用决定了其功能的多样性。已有研究报道与正常组织相比,PTBP1在乳腺癌组织中高表达,在细胞系检测中同样发现PTBP1在乳腺癌细胞系中高表达,PTBP1能促进乳腺癌细胞的生长和侵袭,但具体机制目前尚不清晰。PTEN-AKT信号转导通路与肿瘤有着广泛而密切的关系,其失衡不仅促进肿瘤的发生于发展,而且可促进肿瘤的侵袭与转移,并参与肿瘤的免疫逃逸。自噬作用在肿瘤的进程中也起着重要的作用。机体大约30%的蛋白质均可发生不同形式的磷酸化,其磷酸化位点主要发生于酪氨酸、丝氨酸与苏氨酸残基,蛋白质磷酸化的异常往往导致细胞生命活动的异常,甚至产生细胞损伤或细胞癌变。P21活化激酶(P21-activated kinase,PAK)为一类保守的丝/苏氨酸蛋白激酶。可被生长因子及其他细胞外信号活化,并通过众多的下游结合蛋白或激酶底物,调节控制许多生物学功能,在细胞骨架重组、细胞极性调控、细胞迁移、基因转录调控,特别是在细胞的恶性转化和肿瘤细胞侵袭转移中具有重要作用。PAK5作为II类PAK的最新发现且研究最少的成员,与肿瘤的发生发展密切相关。本研究探讨PTBP1对乳腺癌癌细胞生长,迁移及侵袭的作用及机制,探讨PTBP1如何通过PTEN/Akt通路和细胞自噬影响乳腺癌细胞的生长,以及PAK5对PTBP1磷酸化作用,为明确乳腺癌发生发展的分子机制提供依据。方法:1.验证PTBP1在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达:(1)Western blot实验分析PTBP1在乳腺癌细胞系的蛋白表达情况;(2)Western blot实验分析PTBP1在乳腺癌组织的表达;(3)免疫组织化学实验分析PTBP1在乳腺癌组织的表达。2.证实PTBP1在乳腺癌发展中的重要意义:(1)MTT实验证实PTBP1对乳腺癌细胞生长的影响;(2)克隆形成实验证实PTBP1对乳腺癌细胞生长的影响;(3)Transwell实验检测PTBP1对乳腺癌细胞迁移和侵袭的影响;(4)裸鼠荷瘤实验证实PTBP1对乳腺癌细胞生长的影响。3.PTBP1促进乳腺癌细胞生长的机制研究:(1)Western blot实验证实PTBP1对PTEN-Akt通路的影响;(2)Western blot实验证实PTBP1对细胞自噬的影响;(3)Western blot实验分析PAK5与PTBP1蛋白表达的相关性。4.PAK5与PTBP1相互作用的验证:(1)TNT结合GST pulldown实验,证实PAK5与PTBP1在体外直接结合;(2)免疫共沉淀实验,证实PAK5与PTBP1的体内相互作用;(3)在乳腺癌细胞中过表达PAK5,Western Blot检测PAK5对PTBP1蛋白表达的影响;(4)体外激酶分析实验检测PAK5对PTBP1的磷酸化影响。结果:1.验证PTBP1在乳腺癌细胞系及乳腺癌组织中的表达:(1)PTBP1在乳腺癌细胞系中呈高表达;(2)PTBP1在乳腺癌组织中呈高表达。2.证实PTBP1在乳腺癌发展中的重要意义:(1)PTBP1能促进乳腺癌细胞生长;(2)PTBP1促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭;(3)PTBP1能促进裸鼠体内乳腺癌细胞的生长。3.PTBP1促进乳腺癌细胞生长的机制研究:(1)PTBP1通过下调PTEN激活p-Akt通路;(2)PTBP1抑制细胞自噬;(3)PTBP1与p-Akt在乳腺癌组织呈强相关性表达。4.PAK5与PTBP1相互作用的验证:(1)PAK5与PTBP1能够在体外直接结合;(2)PAK5与PTBP1能够在体内相互作用;(3)PTBP1是PAK5新的生理性底物;(4)PAK5能下调PTBP1表达。结论:1.PTBP1在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中均高表达。2.PTBP1通过PTEN/Akt和自噬促进乳腺癌细胞生长。3.PTBP1为PAK5新的生理性底物。
【学位单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R737.9
【文章目录】：
摘要
Abstract
英文缩略语
第一部分：PTBP1通过PTEN/Akt通路和细胞自噬促进乳腺癌细胞的生长
    1 前言
    2 实验材料和方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 细胞
            2.1.3 临床病例与动物
            2.1.4 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 克隆PTBP1基因的全长,构建到不同质粒载体中
            2.2.2 细胞培养
            2.2.3 脂质体转染法转染
            2.2.4 蛋白提取
            2.2.5 Western Blot
            2.2.6 慢病毒转染
            2.2.7 Transwell
            2.2.8 MTT
            2.2.9 细胞总RNA的提取和逆转录反应
            2.2.10 Real-time PCR反应
            2.2.11 克隆形成
            2.2.12 裸鼠皮下成瘤实验
            2.2.13 免疫组织化学实验
    3 实验结果
        3.1 PTBP1在乳腺癌细胞系和乳腺癌组织中高表达
        3.2 敲低PTBP1乳腺癌稳转细胞系的构建
        3.3 敲低PTBP1抑制乳腺癌细胞的生长和迁移侵袭
        3.4 敲低PTBP1抑制乳腺癌细胞体内生长
        3.5 PTBP1通过PTEN/Akt通路和细胞自噬促进乳腺癌细胞的生长
        3.6 PTBP1与p-Akt具有临床表达相关性
    4 讨论
    5 结论
第二部分：PAK5与PTBP1的相互作用及调控
    1 前言
    2 实验材料和方法
        2.1 实验材料
            2.1.1 主要试剂
            2.1.2 细胞
            2.1.3 实验仪器
        2.2 实验方法
            2.2.1 克隆PTBP1基因的全长,构建到不同质粒载体中
            2.2.2 体外GST-pulldown
            2.2.3 脂质体转染法转染
            2.2.4 蛋白提取
            2.2.5 Western Blot
            2.2.6 免疫共沉淀
            2.2.7 体外激酶分析验证蛋白的磷酸化
            2.2.8 Transwell
            2.2.9 慢病毒转染
    3 结果
        3.1 PAK5在乳腺癌组织中呈高表达
        3.2 PAK5诱导乳腺癌细胞发生EMT
        3.3 PAK5促进乳腺癌细胞的迁移和侵袭
        3.4 PAK5与PTBP1相互作用的验证
        3.5 PTBP1是PAK5新的生理性底物
        3.6 PAK5对PTBP1表达的调控
    4 讨论
    5 结论
本研究创新性的自我评价
参考文献
综述
    参考文献
攻读学位期间取得的研究成果
致谢
个人简历

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