PD-1介导的免疫抑制在老年髋部骨折术后感染易感性中的作用及初步机制探索

发布时间：2020-10-10 00:13

【摘要】：髋部骨折是老年人最常见的骨质疏松性骨折之一,其发病率随着我国人口老龄化进程正迅速持续增高。大量临床资料表明,肺部感染是老年人髋部骨折术后最常见的并发症之一,而由肺部感染导致的多器官功能衰竭则是最常见的死亡原因。创伤及手术打击导致的机体免疫功能障碍与肺部感染、脓毒血症及多器官功能衰竭等并发症的发生密切相关。创伤后免疫功能障碍通常表现为免疫细胞抗原识别、抗原递呈、T细胞活化及炎症因子分泌等生物学过程受到明显抑制,机体清除病原菌的能力降低,感染易感性增加,容易发生肺部感染、脓毒血症及多器官功能衰竭等严重并发症。老年人由于衰老所致的免疫代偿能力减弱,在遭受创伤及手术打击时,发生免疫抑制的可能性更大,程度往往也更重,更容易罹患感染性并发症而死亡。目前关于创伤后免疫抑制的相关研究大多只是观察到一种现象,缺乏机制性研究及有效的干预手段,且国内外针对老年群体创伤后免疫抑制的研究十分罕见,这与目前全球人口老龄化特征不符,因此,探索老年髋部骨折术后免疫功能抑制的分子机制,寻找新的可能的干预靶点,无疑对降低术后肺部感染及死亡率具有重要意义。程序性死亡受体1(Programmed death-1,PD-1)是机体一种重要的免疫抑制分子,主要表达于T细胞表面,对T细胞功能起负调控作用。大量研究已表明,PD-1在肿瘤、慢性病毒感染及脓毒血症所引起的免疫抑制过程中起着举足轻重的作用,体内及体外实验均证实将PD-1基因敲除或给予抗PD-1抗体可明显逆转T细胞功能衰竭,维持T细胞功能,提高存活率,且阻断PD-1的药物在临床上已经用于提高晚期恶性肿瘤患者的免疫功能,并获得良好的结果,但PD-1在创伤术后免疫抑制和感染并发症中的具体作用及分子机制尚不明确。因此我们假设:髋部骨折和手术可导致老年机体出现免疫功能障碍,T细胞PD-1表达增加,从而抑制T细胞应答,降低机体免疫功能及细菌清除率,感染易感性增加;如果给予抗体阻断PD-1,则有可能逆转术后免疫抑制,促进机体抗感染能力的恢复,降低肺部感染率及死亡率。1.1建立老年股骨近端骨折+股骨髓内针内固定术动物模型,了解老年髋部骨折术后免疫炎症反应及细菌易感性的变化。1.2明确临床中老年髋部骨折患者围手术期外周血t细胞pd-1表达变化,分析其与感染并发症的关系。1.3明确pd-1阻断剂对提高老年髋部骨折术后免疫功能、恢复t细胞功能,降低感染率及死亡率的作用。2.方法2.1通过c臂定位下闭合打砸法建立股骨近端骨折大鼠模型,采用切开复位克氏针内固定术模拟股骨髓内针内固定术,分别于术后第1、3、5天检测动物外周血炎症因子(tnf-α、il-1β、il-6、il-10)水平、支气管肺泡灌洗液中蛋白浓度及炎症细胞计数(总细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞)、肺组织casepase-3活性、肺组织病理检查及损伤评分。然后分别于术后第1、3、5天气管内人工接种铜绿假单胞菌菌液,接种后24小时观察血液及支气管肺泡灌洗液中细菌负荷和14天死亡率。2.2收集我科2013年8月至2014年6月间老年股骨粗隆间骨折患者共119例,通过流式细胞术检测入院后第1天、术后第1天、术后第3天及术后第5天外周t细胞pd-1表达。2.3复制小鼠髋部骨折+股骨髓内针内固定术模型,术后立即给予pd-1阻断剂干预,采用流式细胞术和免疫荧光法检测小鼠脾和肺组织pd-1表达和t细胞凋亡情况,elisa检测外周血炎症因子表达(ifn-γ、il-10、il-2);对损伤后接受pd-1阻断剂干预的小鼠实施人工感染铜绿假单胞菌菌液,24小时后评估细菌负荷并观察14天死亡率。3.结果3.1老年大鼠股骨近端骨折+股骨髓内针内固定术模型操作简单、可控,成功率高,术后14天成活率可达90%,变异浮动较小。髋部骨折及髓内针手术打击可导致老年大鼠在术后早期(1-3天)出现明显的全身免疫炎症反应和肺损伤,表现为血浆炎症因子(il-6、tnf-α、il-1β、il-10)水平明显增高,支气管肺泡灌洗液蛋白浓度和炎症细胞计数(巨嗜细胞、淋巴细胞、中性粒细胞)显著增加,肺组织casepase-3活性增强及明显的病理改变,但以上改变具有一定的自限性,无干预情况下至术后第7天基本恢复正常。老年大鼠髋部骨折术后第1天和第3天细菌易感性明显增高,表现为在该时间点给予人工气管滴注铜绿假单胞菌后,血液及支气管肺泡灌洗液中的细菌负荷显著增加,且14天存活率明显降低。3.2老年髋部骨折患者髓内针内固定术后外周血t细胞pd-1表达明显增高,至术1.目的后第5天仍未降至术前水平;有感染并发症的老年髋部骨折患者术后外周血T细胞PD-1表达持续增高,术后第3天达高峰,至术后第5天仍未降至术前水平,而无感染并发症患者外周血T细胞PD-1表达仅在术后第1天呈一过性增高。术后第3天与术后第1天T细胞PD-1表达的差值(PD-1D3-D1)预测术后28天内感染并发症发生的敏感性和特异性均较高,大于3.4%时具有良好的预警价值。3.3髋部骨折及手术打击可明显增高老年小鼠脾脏及肺脏CD3+T细胞PD-1表达,及T淋巴细胞凋亡,提前经鼠尾静脉给予抗PD-1抗体可明显降低PD-1表达并抑制淋巴细胞凋亡;抗PD-1抗体可显著提高老年小鼠髋部骨折术后的抗感染能力,减轻免疫抑制程度,部分恢复T细胞分泌功能;抗PD-1抗体可明显降低老年小鼠髋部骨折术后铜绿假单胞菌感染后支气管肺泡灌洗液及血液中细菌负荷,14天存活率从25%-33.3%提升至58.3%。4.结论4.1髋部骨折及髓内针内固定术可导致老年大鼠术后早期(1-3)天出现全身炎症反应和肺损伤,同时免疫功能受损、细菌易感性增加。4.2老年髋部骨折患者髓内针内固定术后外周血T细胞PD-1表达增高,术后第3天与术后第1天T细胞PD-1表达的差值(PD-1D3-D1)或许是预测术后感染并发症的可靠指标。4.3 PD-1阻断剂可有效提升老年小鼠髋部骨折术后免疫功能,部分恢复T细胞功能,降低细菌易感性及死亡率。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R687.3
【文章目录】：
缩略语表
英文摘要
中文摘要
第一章 前言
第二章 老年大鼠髋部骨折术后免疫炎症反应及肺部感染易感性变化
    2.1 老年大鼠股骨近端骨折及股骨髓内针内固定术模型制备
        2.1.1 材料与方法
        2.1.2 实验结果
    2.2 髋部骨折及手术打击对老年大鼠全身和局部免疫炎症反应的影响
        2.2.1 材料与方法
        2.2.2 实验结果
    2.3 髋部骨折及手术打击对老年大鼠肺部感染易感性的影响
        2.3.1 材料与方法
        2.3.2 实验结果
    2.4 小结
第三章 老年髋部骨折患者PD-1 表达变化及其与感染并发症关系
    3.1 材料与方法
    3.2 实验结果
    3.3 小结
第四章 PD-1 阻断剂在老年小鼠髋部骨折术后肺部感染易感性中的作用
    4.1 材料与方法
    4.2 实验结果
    4.3 小结
全文讨论
全文总结
参考文献
文献综述一
    参考文献
文献综述二
    参考文献
附录
攻读学位期间的研究成果
致谢

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本文编号：2834425