Resolvin D2对缺血再灌注后脑损伤的保护作用及其机制研究

发布时间：2020-10-15 03:30

　　 第一部分Resolvin D2对缺血再灌注后脑损伤的保护作用研究目的:研究缺血再灌注条件下大鼠脑组织中内源性Resolvin D2(RvD2)表达变化以及外源性给予不同剂量RvD2改善缺血再灌注后脑损伤的效果。方法:1、实验动物分组:将36只成年健康雄性SD大鼠随机分为6组,每组6只,分别为假手术组和5个MCAO/R组,MCAO/R组分为MCAO后12小时,24小时,48小时,72小时和96小时再灌注五个亚组,观察不同时间点内源性RvD2表达变化。将72只成年健康雄性SD大鼠随机分为6组,每组12只,分别为假手术组和5个MCAO/R组(72h),MCAO/R组分别接受vehicle,25ng/kg,50ng/kg和100ng/kg体重的RvD2腹腔注射。2、动物模型制作:利用线栓法制备大鼠MCAO/R模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)进行麻醉,沿正中线颈部切开后暴露右侧颈动脉,分离右侧颈外动脉,并在远端结扎其分支。取一段0.26 mm单丝尼龙鱼线,顶端缓慢加热成圆形,通过右侧颈外动脉根部内腔和颈内动脉进入右侧大脑前动脉,造成右侧中动脉起点阻塞。然后清理伤口,缝合手术切口。栓塞2 h后,去除鱼线,制备再灌注模型。假手术对照不插入尼龙鱼线,其余同前。术中保持肛温36.5 and 37.5℃。各个时间点处死大鼠、灌注取脑并且留取脑标本。3、检测方法及指标:通过ELISA法检测大鼠脑标本中RvD2、白介素-6(IL-6)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)定量表达;TTC染色评估可再生的梗塞面积;神经行为学评分法评定神经功能缺失;干湿重法评定脑水肿程度;TUNEL评定神经元和脑微血管内皮细胞(BMVEC)的凋亡;FJB评定神经元坏死。结果:1.ELISA结果显示,与sham组相比,MCAO/R各组内源性RvD2表达明显下降(P0.01);而在大鼠I/R条件下,48h,内源性RvD2表达至峰值(P0.01);72h,内源性RvD2表达明显下降。2.ELISA结果显示,L-6及TNF-α表达在MCAO/R后72h最明显,这一作用在给予MCAO/R+RvD2后明显改善,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)组改善最明显(P0.05)。3.TTC染色评估,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)组脑梗塞面积改善最明显。4.神经功能评分,与对照组相比,MCAO/R组神经功能缺失明显(P0.01);与MCAO/R组相比,MCAO/R+RvD2(50 and 100 ng/kg)组神经功能缺失明显改善(P0.001)。5.干湿重法显示,与MCAO/R组相比,MCAO/R+RvD2治疗组脑水肿明显减轻(P0.05)。6.凋亡细胞原位末端转移酶标记法(TUNEL)及FLUORO-JADE B荧光染色(FJB)结果显示,72h MCAO/R条件下,与MCAO/R组相比,MCAO/R+RvD2治疗组神经元凋亡明显减少;相比MCAO/R+RvD2(25 ng/kg)及MCAO/R+RvD2(100 ng/kg)组,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)组神经元凋亡数最少(P0.05);BMVEC凋亡指数与神经元凋亡相一致。MCAO/R+RvD2(50 and 100 ng/kg)组神经元坏死改善明显(P0.05)。结论:1.缺血再灌注条件下大鼠脑组织中内源性RvD2表达明显下降;2.外源性给予RvD2可显著减少神经元及血管内皮细胞的坏死,改善缺血再灌注后脑损伤。第二部分Resolvin D2对缺血再灌注后脑损伤的保护作用及其分子机制研究目的:探讨Resolvin D2调控GPR18-ERK1/2-NOS信号通路对缺血再灌注后脑损伤是否有干预作用及其可能的作用机制。方法:1、实验动物分组:将30只成年健康雄性SD大鼠随机分为5组,每组6只,分别为sham组,MCAO/R组,MCAO/R+vehicle组,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)组,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)+O-1918组。2、动物模型制作:利用线栓法制备大鼠MCAO/R模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)进行麻醉,沿正中线颈部切开后暴露右侧颈动脉,分离右侧颈外动脉,并在远端结扎其分支。取一段0.26 mm单丝尼龙鱼线,顶端缓慢加热成圆形,通过右侧颈外动脉根部内腔和颈内动脉进入右侧大脑前动脉,造成右侧中动脉起点阻塞。然后清理伤口,缝合手术切口。栓塞2 h后,去除鱼线,制备再灌注模型。假手术对照只是不插入尼龙鱼线,其余步骤同手术组。术中保持肛温36.5 and 37.5℃。在72h处死大鼠、灌注取脑并且留取脑标本检查。3、检测方法及指标:通过蛋白印迹(Western-blot,WB)法检测大鼠脑标本中GPR18的表达变化;细胞外调节蛋白酶(extracellular signal-regulated protein kinase,ERK)1/2、p-ERK1/2、ZO-1、神经元一氧化氮合酶(n NOS)、内皮细胞一氧化氮合酶(e NOS)和紧密蛋白zonula occludens-1(ZO-1)的表达情况;采用免疫荧光染色来分析GPR18在神经元及BMVEC中的表达;采用免疫共沉淀法测定GPR18和neurons、v WF的相互作用,n NOS和neuron marker(Neu N)的相互作用,e NOS和endothelial cell marker(v WF)的相互作用;TTC染色评估可再生的梗塞面积。结果:1.western blot结果显示,大鼠I/R后72小时,与sham组相比,MCAO/R组GPR18在脑组织神经元及BMVEC中的表达水平明显下降(P0.01);与MCAO/R组相比,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)组中GPR18在神经元及BMVEC中的表达明显增高(P0.05);与MCAO/R组相比,MCAO/R+RvD2组中脑组织及神经元中磷酸化的ERK 1/2表达水平明显增高(P0.01);与sham组相比,MCAO/R组神经元中n NOS表达水平和BMVEC中e NOS表达水平明显下降(P0.05);与MCAO/R组相比,MCAO/R+RvD2组神经元中n NOS表达水平明显增加,BMVEC中e NOS和ZO-1表达水平明显增加(P0.01)。2.免疫共沉淀结果显示,GPR18在脑组织中表达位于神经元及BMVEC,而非胶质细胞。3.TTC染色评估,应用GPR18拮抗物O-1918后,与MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)组相比,MCAO/R+RvD2(50 ng/kg)+O-1918组脑梗塞面积明显增加(P0.01)。4.western blot结果显示,用O-1918拮抗干预后,与MCAO/R+RvD2组相比,MCAO/R+RvD2+O-1918组可以明显降低磷酸化的ERK 1/2表达(P0.05)、降低n NOS、e NOS和ZO-1表达(P0.05)。5.免疫荧光染色结果也显示,大鼠I/R后72小时,与MCAO/R+RvD2组相比,MCAO/R+RvD2+O-1918组脑组织神经元中n NOS表达明显降低(P0.05);BMVEC中e NOS表达明显降低(P0.05)。结论:1.RvD2特异性结合受体GPR18在脑组织中表达主要位于神经元及BMVEC,而非胶质细胞。2.RvD2参与调控GPR18表达水平,外源性给予RvD2,可上调神经元及BMVEC中GPR18表达水平,改善缺血再灌注后脑损伤。3.用O-1918拮抗干预后,脑梗塞面积增加,RvD2保护作用减轻,提示RvD2的保护作用依赖与受体GPR18结合。4.I/R条件下,RvD2提高ERK 1/2磷酸化,增强n NOS、e NOS和ZO-1表达水平,RvD2可能通过调控GPR18-ERK1/2-NOS信号通路减轻I/R后脑损伤。第三部分Resolvin D2与ω-3 fatty acids对缺血再灌注后脑损伤的保护效果及机制研究目的:研究对比Resolvin D2与ω-3 fatty acids对缺血再灌注后脑损伤的保护效果及其机制。方法:1、实验动物分组:将30只成年健康雄性SD大鼠随机分为5组,每组6只,分别为sham组,sham+ω-3组,MCAO/R组,MCAO/R+ω-3组,MCAO/R+Rv D2(50 ng/kg)组。2、动物模型制作:利用线栓法制备大鼠MCAO/R模型。大鼠腹腔注射10%水合氯醛(0.3 ml/kg)进行麻醉,沿正中线颈部切开后暴露右侧颈动脉,分离右侧颈外动脉,并在远端结扎其分支。取一段0.26 mm单丝尼龙鱼线,顶端缓慢加热成圆形,通过右侧颈外动脉根部内腔和颈内动脉进入右侧大脑前动脉,造成右侧中动脉起点阻塞。然后清理伤口,缝合手术切口。栓塞2 h后,去除鱼线,制备再灌注模型。假手术对照只是不插入尼龙鱼线,其余步骤同手术组。术中保持肛温36.5 and 37.5℃。在各个时间点处死大鼠、灌注取脑并且留取脑标本检查。3、检测方法及指标:通过ELISA法检测大鼠脑标本中Rv D2表达变化;通过蛋白印迹(Western-blot,WB)法检测大鼠脑标本中5-lipoxygense(5-LOX)and Phos-5-LOX的表达变化;TTC染色评估可再生的梗塞面积。结果:1.TTC染色评估,大鼠I/R后72小时,与MCAO/R+vehicle组相比,MCAO/R+ω-3组梗塞面积减少(P0.05),MCAO/R+Rv D2组脑梗塞面积明显减少(P0.01),与MCAO/R+ω-3组相比,MCAO/R+Rv D2组脑梗塞面积减少(P0.05)。2.ELISA结果显示,与sham组相比,sham+ω-3组(P0.01)、MCAO/R+ω-3组(P0.05),MCAO/R+Rv D2(P0.01)三组中Rv D2表达上升(P0.01)。大鼠I/R后72小时条件下,与MCAO/R+vehicle组组相比,MCAO/R+ω-3组大鼠脑组织中Rv D2表达上升(P0.05),MCAO/R+Rv D2组大鼠脑组织中Rv D2表达明显上升(P0.01);与sham+ω-3组相比,MCAO/R+ω-3组Rv D2表达明显下降(P0.05);与MCAO/R+ω-3组相比,MCAO/R+Rv D2中,Rv D2表达明显上升(P0.05)。3.Western-blot结果显示,与sham组相比,MCAO/R各组Phos-5-LOX明显下降(P0.01);而在大鼠I/R条件下,48h,Phos-5-LOX表达达峰值(P0.01);72h,Phos-5-LOX表达明显下降,这一趋势与ELISA中内源性Rv D2表达趋势一致。结论:1.Resolvin D2对比ω-3 fatty acids对缺血再灌注后脑损伤具有更好的神经保护作用。2.MCAO/R条件下,5-LOX磷酸化受阻,Phos-5-LOX表达下降致ω-3 fatty acids代谢为Rv D2过程抑制,最终内源性Rv D2表达水平下降,可能是Resolvin D2对比ω-3fatty acids具有更好神经保护作用的分子机制。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R651.1
【部分图文】：

图 1 I/R 条件下大鼠脑组织中内源性 RvD2 表达变化及脑损伤变化。2.1.2实验分组2（图 2）成年健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠，所有MCAO/ R组行72h处死，具体如（1）假手术组：12只，假手术对照只是不插入尼龙鱼线，其余步骤同手术（2）MCAO/R组：12只，利用线栓法制备MCAO/ R大鼠I/R模型，再灌注后大鼠，灌注取脑。（3）MCAO/R+ vehicle组：12只，利用线栓法制备MCAO / R大鼠I/R模型，后腹腔注射vehicle，再灌注后的72h处死大鼠，灌注取脑。（4）MCAO/R + RvD2 (25 ng/kg)组：12只，利用线栓法制备MCAO / R大鼠建模成功后腹腔注射RvD2 (25 ng/kg)，再灌注后的72h处死大鼠，灌注取脑（5）MCAO/R + RvD2 (50 ng/kg)组：12只，利用线栓法制备MCAO / R大鼠建模成功后腹腔注射RvD2 (50 ng/kg)，再灌注后的72h处死大鼠，灌注取脑

图 2 第一部分实验动物分组情况及检测指标。外源性注射不同剂量RvD2，大鼠I/R脑损伤变化。2.2 MCAO / R大鼠I/R模型的制作2.2.1 术前准备SD大鼠，安尔碘，天平，1ml、2ml、5ml注射器，托盘，500ml容器+输液管，10%水合氯醛，4%多聚甲醛，0.9%生理盐水，外科手术器械一套（组织剪、持针器、镊子、纹式血管钳、显微血管钳、显微镊、无损伤动脉夹）；5-0及1号丝线，棉球、纱布，操作台，绑鼠板，无影灯。2.2.2 手术步骤（1）10%水合氯醛（药物效量：4ml/kg）对SD大鼠进行腹腔注射麻醉。（2）麻醉成功后，将大鼠仰卧于操作台上，颈部去毛备皮，安尔碘常规消毒。（3）取SD大鼠沿正中线颈部切开后暴露右侧颈动脉CCA，分离右侧颈外动脉ECA，并在远端结扎其分支。

结 果的存活率全部存活，MCAO / R 构建大鼠 I/R 组，部分大鼠会因大脑中停止而死亡。据统计，实验分组 1 MCAO / R 构建大鼠 I/R 模4/50 大鼠），实验分组 2 MCAO / R 构建大鼠 I/R 模型组死亡率为组平均死亡率 16.9%（22/130 大鼠）。大鼠若死亡随机补足每组 条件下，不同时间点大鼠脑组织中内源性 RvD2 的表达变化ELISA 技术检测正常喂养条件下，不同时间点大鼠脑组中内源分析结果显示（图 3）：与 sham 组相比，MCAO/R 各组内源（P<0.01）；而在大鼠 I/R 条件下，48h，内源性 RvD2表达达峰值（性 RvD2 表达明显下降（P<0.05）。
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 Kai Sun;Jingyu Fan;Jingyan Han;;Ameliorating effects of traditional Chinese medicine preparation, Chinese materia medica and active compounds on ischemia/reperfusion-induced cerebral microcirculatory disturbances and neuron damage[J];Acta Pharmaceutica Sinica B;2015年01期

本文编号：2841623