TLR4信号通路在动脉新生内膜形成中的作用及其机制研究
发布时间：2020-10-19 11:03
背景:动脉新生内膜形成引起动脉狭窄,最终导致组织缺血缺氧,是引起心力衰竭或移植物衰败的主要原因,其分子机制目前尚不明确。Toll样受体4(TLR4)作为固有免疫的重要组成部分,其在感染性疾病中的作用已得到较为详尽的阐述,但在动脉新生内膜形成中的作用及其可能的潜在机制,尚未得到阐明。目的:探讨TLR4信号通路在小鼠大动脉新生内膜形成中的作用及其分子机制,寻找可能可行的治疗药物。方法:第一部分1.建立小鼠同种主动脉移植模型,将BALB/c(H-2d)供体主动脉移植到C57BL/6(H-2b)受体中,检测移植物血管相关的病理变化,TLR4的表达及定位。2.TLR4抑制剂干预:对小鼠血管移植模型给予TLR4特异性抑制剂TAK-242处理,手术前1天、手术当天以及随后每隔一天,持续8-12周。3.检测手段和指标:(1)免疫组化及免疫荧光染色检测损伤血管浸润的炎症细胞及TLR4表达情况;(2)RT-q PCR、蛋白印迹检测TLR4信号通路的表达;(3)FACS检测巨噬细胞的比例;(4)ELISA检测共培养体系中炎症因子和趋化因子的表达;(5)建立共培养体系及细胞趋化试验确认作用靶点。第二部分1.建立小鼠内膜增生/动脉重构模型,将右颈总动脉与颈动脉分叉处附近用丝线缝合结扎,检测病变血管相关的病理变化。2.CD40抗体及CD40/TRAF抑制剂干预:对小鼠内膜增生/动脉重构模型给予CD40抗体或者CD40/TRAF抑制剂6877002,持续4周。3.检测方法和指标:(1)免疫荧光、免疫组织化学染色测病变血管浸润的炎症细胞;(2)RT-q PCR、胶原酶活性检测测定MMPs的表达;(4)流式细胞术检测T细胞,B细胞和巨噬细胞的比例;(5)培养骨髓巨噬细胞检测药物作用。结果:第一部分1.本研究成功建立小鼠主动脉移植模型,同种移植移植物血管内膜增生明显多于同系移植物,炎性细胞浸润程度也明显较同系移植物重。TLR4参与小鼠主动脉移植模型的血管内膜增生,其主要定位在巨噬细胞。2.TLR4抑制剂TAK-242阻断TLR4减轻同种异体主动脉移植中的内膜增生,推迟新生内膜的形成;TAK-242通过降低移植后外周血,骨髓和脾脏中Ly6Chi巨噬细胞的生成,减少移植物局部CD68+巨噬细胞的浸润。3.TLR4抑制剂TAK-242通过抑制NF-κB信号通路削弱小鼠血管移植模型中IL12p70/IFNγ轴的影响,从而减少移植物新生内膜中促炎细胞因子和趋化因子表达,减少了CCL2介导的血管平滑肌迁移。第二部分1.本研究成功建立小鼠血管内膜增生/动脉重构模型,TLR4下游CD40阻断后减轻新生内膜形成和动脉重塑,降低新生内膜形成和动脉重塑中明胶酶和胶原酶的活性。2.TLR4下游CD40/TRAF6抑制剂6877002的使用能明显减轻新生内膜形成和动脉重塑,减少炎症浸润和胶原转换,明显抑制了M1极化反应,诱导调节性巨噬细胞亚型的生成。结论:1.TLR4参与了小鼠主动脉移植模型和小鼠血管内膜增生/动脉重构模型的新生内膜形成。其主要机制可能为:(1)参与巨噬细胞极化,促进炎症因子的分泌;(2)促进IL12p70/IFNγ轴自循环,进一步增强炎症反应及组织修复。2.TLR4的抑制剂以及CD40/TRAF6抑制剂分别可明显减两种新生内膜形成模型的血管病变。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R654
【部分图文】：
27图 2.1 小鼠血管移植模型的建立，其免疫指标的变化及 TLR4 表达情况二、 阻断 TLR4 对小鼠血管移植模型血管移植物内膜增生的影响1. TLR4 抑制剂 TAK-242 对血管移植物内膜增生的影响为了解 TLR4 在小鼠血管移植模型血管移植物内膜增生中的作用，使用 TLR4 小分子特异性抑制剂 TAK-242 对同种移植小鼠进行药物干预。实验分四组，包括溶剂组、TAK-242 3mg/kg 治疗组、TAK-242 10mg/kg 治疗组和同系移植组。溶剂组、TAK-242 3mg/kg 治疗组和 TAK-242 10mg/kg 治疗组均为同种移植，将 BALB/c 小鼠的主动脉移植到 B6 小鼠体内，而同系移植组则将 B6 用作供体和受体。按照分组腹腔注射不同药物，在手术前一天单独注射一次，手术当天至手术后第 84 天，每隔一天腹腔注射一次。TAK-242 3mg/kg 治疗组和 TAK-242 10mg/kg 治
28图 2.2 阻断 TLR4 对小鼠血管移植模型血管移植物内膜增生的影响在移植术 8 周后，所有小鼠均存活，并无外观上的差异。按上述方法取血管移植物组织进行 H＆E 染色，显示在 8 周时与同系移植组相比，同种异体移植的各组均出现更明显的同心性内膜增生病变（图 2.2.A）。通过计算内膜中膜比（I/M ratio）发现，
30图 2.3 TLR4 抑制剂 TAK-242 对血管移植物早期炎症细胞浸润的影响3. TLR4 抑制剂 TAK-242 对外周血，骨髓和脾脏中 Ly6Chi 巨噬细胞水平的影响炎症发生时，循环炎性 Ly6Chigh 单核细胞渗入组织，并通过产生细胞因子，蛋白酶和氧化应激促进酶导致炎症产生[27]，构成局部浸润巨噬细胞的主要来源[28]。。为了研究 TAK-242 如何影响循环单核细胞的募集，通过流式细胞术评估溶剂组，TAK-242 治疗组和同系移植组的外周血，骨髓和脾单核细胞。按方法部分描述制备各种单细胞悬液，染色采用抗 CD11b-FITC 荧光抗体，抗 CD115-PE 荧光抗体和抗Ly6C-PERCP-Cy5.5 荧光抗体。在 CD11b+的细胞中，选出 CD115+且 Ly6Chi 的细胞。在溶剂处理的小鼠中，外周血 Ly6Chi 单核细胞占 CD11b+细胞的 12.07±0.47％，但在
【参考文献】
本文编号：2847114
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R654
【部分图文】：
27图 2.1 小鼠血管移植模型的建立，其免疫指标的变化及 TLR4 表达情况二、 阻断 TLR4 对小鼠血管移植模型血管移植物内膜增生的影响1. TLR4 抑制剂 TAK-242 对血管移植物内膜增生的影响为了解 TLR4 在小鼠血管移植模型血管移植物内膜增生中的作用，使用 TLR4 小分子特异性抑制剂 TAK-242 对同种移植小鼠进行药物干预。实验分四组，包括溶剂组、TAK-242 3mg/kg 治疗组、TAK-242 10mg/kg 治疗组和同系移植组。溶剂组、TAK-242 3mg/kg 治疗组和 TAK-242 10mg/kg 治疗组均为同种移植，将 BALB/c 小鼠的主动脉移植到 B6 小鼠体内，而同系移植组则将 B6 用作供体和受体。按照分组腹腔注射不同药物，在手术前一天单独注射一次，手术当天至手术后第 84 天，每隔一天腹腔注射一次。TAK-242 3mg/kg 治疗组和 TAK-242 10mg/kg 治
28图 2.2 阻断 TLR4 对小鼠血管移植模型血管移植物内膜增生的影响在移植术 8 周后，所有小鼠均存活，并无外观上的差异。按上述方法取血管移植物组织进行 H＆E 染色，显示在 8 周时与同系移植组相比，同种异体移植的各组均出现更明显的同心性内膜增生病变（图 2.2.A）。通过计算内膜中膜比（I/M ratio）发现，
30图 2.3 TLR4 抑制剂 TAK-242 对血管移植物早期炎症细胞浸润的影响3. TLR4 抑制剂 TAK-242 对外周血，骨髓和脾脏中 Ly6Chi 巨噬细胞水平的影响炎症发生时，循环炎性 Ly6Chigh 单核细胞渗入组织，并通过产生细胞因子，蛋白酶和氧化应激促进酶导致炎症产生[27]，构成局部浸润巨噬细胞的主要来源[28]。。为了研究 TAK-242 如何影响循环单核细胞的募集，通过流式细胞术评估溶剂组，TAK-242 治疗组和同系移植组的外周血，骨髓和脾单核细胞。按方法部分描述制备各种单细胞悬液，染色采用抗 CD11b-FITC 荧光抗体，抗 CD115-PE 荧光抗体和抗Ly6C-PERCP-Cy5.5 荧光抗体。在 CD11b+的细胞中，选出 CD115+且 Ly6Chi 的细胞。在溶剂处理的小鼠中，外周血 Ly6Chi 单核细胞占 CD11b+细胞的 12.07±0.47％，但在
【参考文献】
相关期刊论文 前1条
1 王薇;武阳丰;赵冬;杨颖;梁立荣;王淼;解武祥;孙佳艺;周广华;史平;任福秀;霍勇;;中老年人群颈动脉粥样硬化分布特点及影响因素分析[J];中华心血管病杂志;2010年06期
本文编号：2847114
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/waikelunwen/2847114.html
最近更新
教材专著
