激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞功能改变及转录组差异的研究

发布时间：2020-10-28 02:35

　　 研究背景:股骨头坏死(Osteonecrosis of Femoral Head,ONFH)是以股骨头血供受损,骨细胞及骨髓成份死亡,继而导致股骨头结构改变、股骨头塌陷、关节功能障碍为特征的骨科常见疾病,高发于青壮年。因股骨头坏死塌陷而行全髋关节置换术的患者占全部全髋关节置换总数的30%,为家庭和社会带来了沉重的经济负担。在中国,激素的应用仍为股骨头坏死发生的首要危险因素,激素性股骨头坏死约占股骨头坏死总数的35%。目前,激素性股骨头坏死的发病机制仍不明确,因而限制了对于激素性股骨头坏死早期诊断方法和干预手段的发展。研究表明,骨髓间充质干细胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSC)的数量减少及细胞行为的改变与激素性股骨头坏死的发生发展密切相关。然而,对于激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞的生物学特性改变存在争议。在前期研究中,课题组在激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中发现了差异表达的miRNA。然而,miRNA的差异表达不能完全阐释激素性股骨头坏死的发生机制,多种非编码RNA可以在转录组层面进行相互作用从而调节基因表达。因此,全面的理解激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中的转录组差异表达可能为进一步的探索其发生机制提供条件。研究目的:1.比较激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞与正常对照之间的细胞功能差异。2.利用高通量测序及生物信息学分析技术,在转录组层面研究激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞差异基因表达。3.在 BMSC 探索差异 lncRNA:lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和lncRNA-RP3-331H24.7 对 BMSC 功能影响4.初步探索 lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7 与 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 的相互作用机制。研究方法:1.骨髓间充质干细胞的分离、培养:从7例激素性股骨头坏死患者和7例正常对照体内取骨髓组织,密度梯度离心法分离培养骨髓间充质干细胞并传代,流式细胞术对细胞表型进行验证。2.通过CCK-8和Edu增殖实验、AnnexinV-PI凋亡实验比较两组骨髓间充质干细胞的增殖能力和凋亡率的差异;诱导骨髓间充质干细胞向成骨、成脂方向分化,通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色以及成骨、成脂标记物的表达情况比较两组之间的分化能力差异。3.通过高通量全基因组测序对两组中各3例骨髓间充质干细胞进行全转录组测序,得到激素性股骨头坏死过程中差异表达的mRNA、miRNA、lncRNA和circRNA。4.通过生物信息学手段对差异基因进行功能富集分析,并对lncRNA和mRNA、circRNA和miRNA进行共表达分析,揭示其相互作用机制。5.在正常BMSC中过表达/低表达过表达lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7,观察其在 BMSC 中与 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p的相互作用以及对于BMSC功能的影响。研究结果:1.分离骨髓间充质干细胞,表面抗原鉴定显示CD29,CD44,CD73,CD90和CD105呈阳性表达,而CD31和CD45呈阴性表达。2.激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞培养24h、48h和72h后,CCK-8吸光度值均显著低于正常对照(24h:0.35±0.02vs0.39±0.04,P=0.02;48h:0.54±0.06 vs0.68±0.08,P=0.004;72h:0.92±0.04vs1.15±0.08,P=0.0006)。培养 24h 后其Edu阳性率为26.67%± 10.85%,显著低于正常对照的66.03%± 8.71%(p=0.0021),提示激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖能力降低。而其总凋亡率为24.64±3.68%,较正常对照组显著增高(17.48±4.05%,p=0.0041)。3.通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色以及成骨(ALP,OCN,RUNX2和BSP)、成脂标记物(PPARY,LPL和FABP4)的检测,发现激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞成骨分化能力减弱,成脂分化能力增强。4.在激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中发现3114个mRNA、572个lncRNA、224个miRNA和231个circRNA差异表达并构建共表达网络。5.lncRNA-RP11-154D6 与 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 的表达趋势呈正相关,且lncRNA-RP11-154D6 可以抑制 BMSC 增殖并促进凋亡;lncRNA-RP3-331H24.6和lncRNA-RP3-331H24.7能够促进BMSC增殖并抑制凋亡过程,且其表达趋势与 miR-30a-5p 和 miR-30c-5p 呈负相关。结论:1.激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖、凋亡及分化能力均较正常细胞改变,可能是导致激素性股骨头坏死发生的原因。2.激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞中存在异常表达的mRNA、miRNA、lncRNA及circRNA,这些异常表达的基因可能通过相互作用影响细胞功能,从而调控激素性股骨头坏死的发生发展。3.lncRNA-RP11-154D6、lncRNA-RP3-331H24.6 和 lncRNA-RP3-331H24.7 可能通过与miR-30a-5p和miR-30c-5p的相互作用,调控BMSC增殖和凋亡过程。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R681.8
【部分图文】：

实验结果??１．骨髄间充质干细胞的形态学观察及表型鉴定??骨髓间充质干细胞贴壁培养时呈长梭形，漩涡状排列。既往文献报道其表面标记??ＣＤ２９，?ＣＤ４４，?ＣＤ７３，?ＣＤ９０?和?ＣＤ１０５?阳性；ＣＤ３１?和?ＣＤ４５?阴性。??在本研究中，培养初期，可见少量梭形贴壁细胞，并伴有大量未贴壁圆形细胞。??延长培养时间并不断更换培养基后贴壁细胞逐渐增多，形态逐渐变为长梭形，局??部有突起，培养１４天后，细胞汇合度可达８０％，细胞呈旋涡状排列（图１Ｈ）。??收集第３代骨髓间充质干细胞，通过流式细胞术检测其表面抗体表型，发现ＣＤ２９，??ＣＤ４４，ＣＤ７３，ＣＤ９０?和?ＣＤ１０５?呈阳性表达，表达率分别为?１００％，?９２．８％，９７．９％，??９５．４％和９９．９％，而ＣＤ３１和ＣＤ４５呈阴性表达，表达率分别为２．６％和０．８％?（图??１Ａ－Ｇ）。??Ａ?Ｂ?Ｃ?Ｄ??

图２Ｂ，??Ｐ＝０．０２）

?中国医学科学院北京协和医学院博士研宄生学位论文???图２激素性股骨头坏死骨髓间充质干细胞增殖能力下降??３．激素性股骨头坏死患者骨髓间充质干细胞凋亡率明显升髙??我们通过ＡｎｎｅｘｉｎＶ－ＰＩ染色法对两组中全部１４例骨髓间充质干细胞进行了凋亡??检测。在激素性股骨头坏死组全部７例骨髓间充质干细胞中，总凋亡率为??２４．６４±３．６８％，较正常对照组显著增高（１７．４８±４．０５％，ｐ＝０．００４１）。其中，两组细??胞之间的早期凋亡率未见统计学差异（６．４２±２．１３°／〇ｖｓ５．２９±２．１６°／。；ｐ＝０．４４５８），而??激素性股骨头坏死组骨髓间充质干细胞的晚期凋亡细胞比例较正常显著增高，两??者具有统计学差异（１８．２１±３．０８％ｖｓｌ２．１９±２．００％；ｐ＝０．０００６）。图３Ａ罗列了两组??中各３例凋亡检测的代表性结果（上列为激素性股骨头坏死组，下列为正常对照??组），图３Ｂ、３Ｃ和３Ｄ分别显示了两组骨髓间充质干细胞早期凋亡率、晚期凋亡??率和总凋亡率的统计学结果。??Ａ??
【参考文献】

相关期刊论文 前3条

1 程相国;胡斌;盛加根;张长青;;应用基因芯片技术对激素性股骨头缺血性坏死差异表达基因筛选的初步研究[J];中国修复重建外科杂志;2014年05期

2 夏天;肖丙秀;郭俊明;;长链非编码RNA的作用机制及其研究方法[J];遗传;2013年03期

3 张驰;;成骨细胞特异性转录因子Osterix对骨形成作用的分子机制(英文)[J];北京大学学报(医学版);2012年05期

本文编号：2859444