CPT诱导人外周血源破骨细胞凋亡的分子机制研究

发布时间：2020-10-31 07:31

　　 目的:肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor Necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand,TRAIL)是肿瘤坏死因子(Tumor Necrosis factor,TNF)超家族新成员。体外实验发现可诱导多种组织来源的肿瘤细胞凋亡,而对正常组织细胞几乎没有影响。但有关TRAIL对破骨细胞作用的研究报道并不多见。继往的研究已证实环化变构肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Circular Permuted TRAIL,CPT;北京沙东生物技术有限公司研发)可以较TRAIL更有效地诱导肿瘤细胞凋亡。我们研究CPT对人外周血来源的破骨细胞的作用,在mRNA水平分析化疗药作用后其两种CPT死亡受体和两种诱骗受体表达的变化,探讨CPT对破骨细胞的作用机制,为临床骨髓瘤骨病等的治疗新的治疗方法和理论依据。方法:1人外周血来源破骨细胞细胞培养采取健康人外周血10ml,共6人份。淋巴细胞分离液无菌分离PBMC,接种24孔板,接种密度分别为5×10~5、1×10~6、2×10~6细胞/每孔,加入含30ng/ml M-CSF+30ng/ml RANKL培养基诱导培养21天形成贴壁、胞体较大形状不规则且多核(大于等于3个核)的细胞。2破骨细胞的鉴定2.1抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase,TRAP)试剂盒染色,多个核(大于等于三个核)、胞体较大、酒红色细胞为成熟破骨细胞。取出24孔细胞培养板中的预置爬片,按照TRAP染色步骤进行染色。用显微镜(100×)普通光照下观察并拍照。每次取4个孔,随机选取10个视野计数3个核以上的破骨细胞。2.2扫描电子显微镜观察破骨细胞作用于牛皮质骨片后形成的骨吸收陷窝。3 CPT诱导破骨细胞的凋亡3.1不同浓度CPT对破骨细胞作用,CPT药物浓度分别为0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml,作用24小时、48小时后进行trap染色,倒置显微镜下观察破骨细胞形态变化。3.2annexinv–fitc荧光染色法检测CPT诱导破骨细胞凋亡:将CPT0ng/ml、100ng/ml、500ng/ml处理后的破骨细胞在annexinv–fitc荧光染色剂中37℃孵育15分钟,荧光显微镜下观察凋亡的破骨细胞。4rt-pcr法检测破骨细胞中CPT受体mrna表达变化的影响以0ng/ml、100ng/ml、500ng/mlCPT处理破骨细胞24h、48h后,实时荧光定量pcr(realtimefluorescencequantitativepcr,rt-pcr)法检测dr4、dr5、dcr1及dcr2mrna水平表达变化,分析其与CPT诱导的破骨细胞凋亡的相关性。5统计学:应用spss19.0(spssinc,usa)软件对数据进行单因素方差(one-wayanova)分析,统计结果以平均值±标准差表示。大写字母代表着差异性极显著(p0.01);小写字母代表着差异性显著(p0.05)。结果:1外周血单个核细胞经m-csf及rankl诱导21天后显微镜下可见到大量成熟的破骨细胞,其形态学特征为:细胞体积较大,细胞浆丰富呈酒红色,多核,细胞核≥3个,甚至多达数十个。该细胞进行trap染色呈现阳性(酒红色),进行骨片吸收实验显示其较强的骨吸收活性。证实可以经pbmc诱导形成具有骨吸收活性的破骨细胞。在相同的培养条件下pbmc细胞在2×10~6个/ml接种密度下,诱导形成的破骨细胞数量为50.2±11.6/hpf,于5×10~5个/ml诱导形成的破骨细胞数量18.0±6.37/hpf及1×10~6个/ml诱导形成的破骨细胞数量36.4±9.54/hpf相比,诱导形成的破骨细胞数量最多。2CPT诱导破骨细胞凋亡形态学变化,显微镜下观察到CPT作用24小时后破骨细胞出现空泡化、变形,48h后破骨细胞的封闭带出现破裂或者消失等凋亡特征。3CPT诱导破骨细胞早期凋亡凋亡annexinv–fitc荧光染色,荧光显微镜下观察到不同浓度CPT作用于破骨细胞后典型的早期凋亡特征,CPT诱导破骨细胞凋亡呈现一定的时间-浓度依赖性。4CPT对破骨细胞CPT相关受体mrna表达的影响:dr4、dr5、DcR1及DcR2在破骨细胞上均有表达。经100ng/ml、500ng/mlCPT处理破骨细胞24h,CPT的相关受体DR4、DR5、DcR1及DcR2的mRNA表达水平变化不显著(P0.05);处理48h后,DR4和DcR2的mRNA表达水平仍无显著变化(P0.05),DR5及DcR1的mRNA表达水平下调(P0.05或P0.01)。推断CPT是通过DR5诱导破骨细胞凋亡。结论:1可以由人PBMC诱导形成的具有骨吸收活性的破骨细胞。2 CPT可诱导人外周血源的破骨细胞发生凋亡。其诱导作用呈时间及浓度依赖性。3 CPT作用破骨细胞一定时间后可降低DR5、DcR1的mRNA表达,但不影响受体DR4、DcR2mRNA表达,推断CPT通过DR5、DcR1参与调控OC的凋亡。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R68
【部分图文】：

18附 图图1-1 接种不同密度PBMC诱导产生的TRAP阳性破骨细胞（A：5×105个/ml；B：1×106个/ml；C：2×106个/ml）（100X）Fig.1-1After the induction of different cell seeding density, the osteoclastswere observed in TRAP staining图1-2 不同细胞接种密度诱导产生的破骨细胞数量（100X）Fig.1-2 StatisticalAnalysis of the osteoclast number注：大写字母代表着差异性极显著（P<0.01）；小写字母代表着差异性显著（P<0.05）Different lower alphabets and upper alphabets were considered to indicatesignificance (P<0.05) and high significance (P<0.01), respectively

Fig.1-1After the induction of different cell seeding density, the osteoclastswere observed in TRAP staining图1-2 不同细胞接种密度诱导产生的破骨细胞数量（100X）Fig.1-2 StatisticalAnalysis of the osteoclast number注：大写字母代表着差异性极显著（P<0.01）；小写字母代表着差异性显著（P<0.05）Different lower alphabets and upper alphabets were considered to indicatesignificance (P<0.05) and high significance (P<0.01), respectively

研 究 论 文19图1-3 骨吸收陷窝Fig. 1-3 Resorption lacunae图2-1 RNA琼脂糖凝胶电泳Figure 2-1 RNAto agarose gel electrophoresis图 2-2 CPT 对破骨细胞形态的影响（100×）Fig.2-2 Effects of CPT on osteoclast morphology（100×）28s18s5s
【参考文献】

相关期刊论文 前2条

1 Lianping Xing;Yan Xiu;Brendan F Boyce;;Osteoclast fusion and regulation by RANKL-dependent and independent factors[J];World Journal of Orthopedics;2012年12期

2 潘淳;何波;杨雪婷;陈鹏;沈志强;;诱导法与机械法体外培养破骨细胞的比较研究[J];昆明医科大学学报;2012年09期

本文编号：2863642