成骨细胞是骨形成的主要功能细胞之一,成骨细胞的增殖和分化功能受到抑制时,会使骨形成减慢,骨代谢失衡,并最终导致骨质疏松。成骨细胞的功能受到多种因素的影响,包括成骨细胞内部的表观和非表观遗传学因素,以及细胞外界的一些力学刺激等。但成骨细胞响应力学刺激并启动内部信号通路的机制至今仍不明确。微管微丝交联分子(microtubule actin crosslinking factor 1,MACF1)是连接微丝和微管的细胞骨架蛋白,MACF1可以调控细胞骨架动力学,进而参与力学刺激响应、细胞信号转导、细胞迁移、以及疾病发生等生物学过程。本团队前期研究表明,MACF1在成骨细胞增殖、分化过程中起重要作用。但MACF1对成骨细胞增殖和分化的调控机制目前尚未明确。因此,本研究目的旨在阐明MACF1对成骨细胞增殖调控作用及机制;并结合MACF1相关非编码RNA,研究其对对成骨细胞分化的调控作用。为深入研究力学条件下MACF1的功能和成骨细胞增殖和分化的机制提供了理论和实验基础,并且也对寻找骨质疏松诊断和治疗的新靶点具有非常重要的意义。研究方法:本研究首先采用三维随机回转仪和小鼠尾悬吊后肢去负荷模型,检测在力学去负荷条件下MACF1在MC3T3-E1小鼠前成骨细胞以及C57BL/6小鼠股骨组织和股骨骨源间充质干细胞中的表达变化;采用MACF1高/低表达MC3T3-E1前成骨细胞模型,研究MACF1对成骨细胞碱性磷酸酶活性、细胞矿化结节生成、成骨分化相关基因表达和细胞增殖速率的影响,并结合力学去负荷条件,检测MACF1在力学去负荷条件下对β-catenin表达水平和活性的影响,以及β-catenin对成骨细胞增殖的调控作用。进一步通过对MACF1低表达前成骨细胞进行LncRNA、miRNA、mRNA表达谱基因芯片分析,结合生物信息学分析手段,筛选MACF1相关的成骨分化非编码RNA,并通过CHIP-seq和JASPAR数据库预测MACF1对筛选获得的非编码RNA的调控作用。在老龄和尾悬吊骨质疏松小鼠模型股骨组织中检测筛选获得的Lnc-DIF和miR-489-3p的表达变化。在前成骨细胞中转染Lnc-DIF-siRNA或miR-489-3p模拟物/抑制物,检测细胞的成骨分化标志基因表达水平、碱性磷酸酶活性和矿化结节生成速率、以及转染Lnc-DIF-siRNA对前成骨细胞miR-489-3p水平的变化。通过荧光原位杂交技术,检测Lnc-DIF在MC3T3-E1前成骨细胞中的分布情况。通过荧光素酶报告基因检测技术,检测了前成骨细胞中Lnc-DIF对miR-489-3p的结合作用。使用成骨细胞靶向递送系统在去卵巢骨质疏松小鼠模型中转染Lnc-DIF-siRNA,通过microCT技术检测小鼠骨微结构的变化。检测转染AK016739-siRNA后,前成骨细胞的碱性磷酸酶活性、矿化结节生成速率、以及成骨分化标志基因和成骨相关转录因子水平的表达水平。并分别采用超景深显微镜、钙黄绿素标记、免疫组化和RT-PCR方法检测去卵巢骨质疏松小鼠转染AK016739-siRNA后的颅骨厚度、骨形成速率、成骨标志因子蛋白水平和成骨相关转录因子表达变化。研究结果:(1)MACF1参与成骨细胞对力学条件的响应,调控成骨细胞功能在三维随机回转力学去负荷条件处理24和48 h后,小鼠前成骨细胞MC3T3-E1中MACF1的mRNA和蛋白表达水平均降低;在28天的尾悬吊力学去负荷处理后,小鼠股骨组织中MACF1的mRNA和蛋白水平,以及股骨骨源间充质干细胞中MACF1的mRNA水平也明显下调。在MACF1高/低表达前成骨细胞中,细胞的碱性磷酸酶活性、矿化结节生成和成骨分化相关基因表达均受到MACF1的正调控,同时细胞的增殖速率和增殖细胞比率也受到MACF1的正调控。力学去负荷条件对成骨细胞增殖的抑制作用受到了MACF1表达水平的影响:MACF1低表达时力学去负荷条件对成骨细胞的增殖抑制作用较弱。此外,结果显示在MACF1高/低表达前成骨细胞中,β-catenin的mRNA与蛋白表达和β-catenin的活性也受到了MACF1的正调控;并且力学去负荷条件抑制β-catenin的mRNA表达的作用也在MACF1低表达时减弱。以siRNA干扰β-catenin表达可以抑制成骨细胞增殖,而氯化锂处理则对上述过程有恢复效果。综合分析以上结果,表明:力学去负荷条件抑制成骨细胞中的MACF1表达;MACF1参与成骨细胞响应力学去负荷条件,且正调控成骨细胞的增殖和分化;此外,MACF1对成骨细胞增殖的调控,通过β-catenin信号通路实现。(2)MACF1相关非编码RNA——Lnc-DIF及mir-489-3p的筛选及其对成骨细胞分化和骨形成的调控作用MACF1低表达前成骨细胞的lncRNA、miRNA、mRNA表达谱芯片的生物信息学分析结果显示:miR-489-3p在MACF1低表达成骨细胞中表达降低,且与成骨分化基因相关性最好,而Lnc-DIF在MACF1低表达成骨细胞中表达升高,且Lnc-DIF序列中存在多个miR-489-3p结合位点。CHIP-seq和JASPAR数据库预测结果发现了MACF1结合的转录因子在Lnc-DIF启动子区域存在结合位点,说明MACF1可能调控Lnc-DIF的转录。因此推测,MACF1通过调控Lnc-DIF表达,影响miR-489-3p对靶基因—成骨分化相关基因—的调控。在老龄和尾悬吊骨质疏松小鼠模型的股骨组织中,Lnc-DIF表达升高。在前成骨细胞中转染Lnc-DIF的siRNA可以上调成骨分化标志基因表达,并且提高细胞碱性磷酸酶活性和矿化结节生成水平。荧光原位杂交结果表明Lnc-DIF在MC3T3-E1前成骨细胞中主要分布在细胞质中;转染Lnc-DIF-siRNA可升高前成骨细胞miR-489-3p水平,通过荧光素酶报告基因检测证明了Lnc-DIF可以结合miR-489-3p。采用骨靶向递送系统经小鼠尾静脉注射Lnc-DIF的siRNA可以恢复去卵巢骨质疏松小鼠的骨微结构。miR-489-3p在老龄骨质疏松患者骨组织、以及老龄和尾悬吊骨质疏松小鼠模型股骨组织中低表达。在前成骨细胞中转转染miR-489-3p的模拟物或抑制物,分别促进/抑制成骨细胞分化。综合分析以上结果,表明:MACF1可能通过转录因子负调控Lnc-DIF,而Lnc-DIF则通过结合miR-489-3p,抑制成骨细胞分化和骨形成。(3)MACF1相关长链非编码RNAAK016739的筛选及其对成骨细胞分化和骨形成的调控作用MACF1低表达前成骨细胞的基因芯片分析结果显示,AK016739是与成骨分化基因相关性最好的长链非编码RNA。采用CHIP-seq和JASPAR数据库预测转录因子的手段验证了MACF1对其的调控作用。在MC3T3-E1前成骨细胞中转染AK016739的siRNA可以提高成骨细胞碱性磷酸酶活性和矿化结节生成水平,并且促进成骨细胞分化标志基因和成骨分化相关转录因子的表达。体内转染AK016739的siRNA可以恢复去卵巢骨质疏松小鼠的颅骨厚度、骨形成速率、成骨标志因子蛋白水平和成骨相关转录因子的表达水平。综合分析以上结果,表明:MACF1可以通过转录因子负调控AK016739,而AK016739则可以抑制成骨细胞分化和骨形成。结论:综上所述,MACF1在成骨细胞响应力学去负荷条件中扮演重要角色,并且对成骨细胞的增殖和分化功能起正调控作用。MACF1可以通过β-catenin来促进成骨细胞增殖。此外,还可以通过其下游的非编码RNA:Lnc-DIF-miR-489-3p轴和AK016739正调控成骨细胞分化和骨形成。本研究阐明了力学响应分子MACF1对成骨细胞增殖和分化的调控作用及调控机制,并且发现了新的调控成骨细胞分化的表观遗传学信号通路。本研究为阐明成骨细胞对力学去负荷条件的感知以及其对骨形成的影响提供了理论基础,同时也对骨代谢相关疾病的防治提供了新的潜在治疗靶点。
【学位单位】：西北工业大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R68
【部分图文】：
MACF1的结构
促进β-catenin 的入核以及下游转录因子 TCF7/LEF1 的活性（图 1-2）。胡丽年的研究也证明了 MACF1 可以在成骨细胞中调控β-catenin 的入核和降解，MACF1 可以通过调控 Wnt/β-catenin 信号通路促进成骨细胞分化[109]。此外，可以调控高尔基体相关的蛋白运输[110, 111]，高尔基体是负责细胞内部合成蛋运的细胞器，而研究表明，MACF1 可以调控高尔基体内加工后的蛋白囊泡的反式面转运到细胞内的微管上的驱动蛋白，从而调控细胞内蛋白的分配[1MACF1分子上还存在一个GSK-3β的磷酸化位点，这暗示了MACF1可能会调的功能[101, 112]。
图 1-3 lncRNA 的功能[152]Fig.1-3 Functions of lncRNAslncRNA 对转录的调控可以通过直接与染色体结合，并调控基因的组蛋白修饰水平，影响基因的转录。研究发现，包括 Xist、Tsix 和 Xite 在内的多种 lncRNA 都可以通过召集组蛋白 H3K27 甲基化酶复合体或组蛋白甲基化转移酶的方式使基因失活。研究发现，Xist（X 染色体失活特异转录因子，X-inactive specific transcript）可以在染色体失活中心与 RepA 和 PRC2 形成复合物，并结合到 lncRNAXist 的启动子区，反式激活 Xist 的转录表达，随后 Xist 与 PRC2 结合，并沿 X 染色体移动使 X 染色体失活[153]。此外，lncRNAKcnqlot1 可以通过召集 PRC2 的方式，通过甲基化修饰等方法使目标基因失活[154]。而lncRNA HOTTIP 则可以召集 WDR5/MLL 复合物使 HOXA 位点甲基化，从而激活位点附近基因的表达[155]。此外，lncRNA 对转录的调控除了可以召集并形成转录调控复合物的方式以外，还可以通过与转录因子结合的方式调控基因表达。例如，lncRNAPANDA可以结合转录因子 NF-YA，对促凋亡基因的表达起抑制作用[156]。lncRNA 可以通过调控 mRNA 的可变剪接来对转录后的 mRNA 进行调控。mRNA在转录后，其前体（pre-mRNA）必须通过可变剪接产生不同的转录本，继而翻译成不
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本文编号：
2865419
