褪黑素对肠缺血再灌注大鼠脑损伤的影响及相关机制研究

发布时间：2020-11-05 19:14

　　 目的:证实小肠缺血再灌注(ischemia reperfusion,I/R)所致脑损伤发病机制中小胶质细胞TLR4/My D88信号通路的作用;探讨褪黑素能否通过抑制小胶质细胞TLR4/MyD88信号通路,发挥抗炎症、抗氧化及抗凋亡作用,继而对肠缺血再灌注所致脑损伤发挥脑保护作用。方法:选取SD大鼠100只随机分成:假手术(Sham)组、小肠缺血再灌注(I/R)组、低剂量褪黑素(LMT)组、高剂量褪黑素(HMT)组以及溶媒(Veh)组。夹闭肠系膜上动脉90 min,再灌注2天,建立肠缺血再灌注模型。通过水迷宫实验观察各组大鼠认知功能改变,利用HE染色了解脑皮质及海马神经细胞的形态学改变,TUNEL法检测各组大鼠额叶皮层及海马CA1区细胞凋亡情况,利用ELISA试验检测TNF-α、IL-6和IL-1β的水平,通过生化法检测MDA、SOD以及ROS的活性,Western blot测定TLR4、MyD88、Cleaved Caspase-3、和NF-κB蛋白表达,利用多重免疫荧光染色等方法观察小胶质细胞活性及TLR4、MyD88表达。实验数据采用SPSS 17.0统计软件进行统计学分析,多样本均数多重比较采用单因素方差分析,P0.05为差异有统计学意义。结果:1.与Sham组相比,I/R组大鼠认知功能明显受损,额叶皮质及海马神经元损伤严重(P0.01),与I/R组比较,LMT组和HMT组认知功能及神经元损伤减轻,尤其HMT组减轻更明显(P0.05或P0.01),Veh组损伤结果与I/R组无明显差异(P0.05),其中各组大鼠额叶皮质的正常神经细胞数目分别为:Sham组为(518±72)/mm~2,I/R组为(210±25)/mm~2,LMT组为(307±43)/mm~2,HMT组为(452±48)/mm~2,Veh组为(237±45)/mm~2;各组大鼠海马的正常神经细胞数目依次为:Sham组为(308±37)/mm~2,I/R组为(162±12)/mm~2,LMT组为(203±24)/mm~2,HMT组为(275±28)/mm~2,Veh组为(150±10)/mm~2;2.TUNEL染色法检测结果显示Sham组大鼠额叶皮质及海马CA1区细胞凋亡程度较轻,其他各组细胞凋亡明显(P0.01),与I/R组比较,LMT组和HMT组细胞凋亡比例下降(P0.05或P0.01),其中各组额叶皮质凋亡率分别为:Sham组为(5±1)%,I/R组为(86±10)%,LMT组为(63±5)%,HMT组为(54±4)%,Veh组为(88±9)%;各组大鼠海马CA1区的凋亡阳性细胞比率依次为:Sham组为(5±1)%,I/R组为(90±7)%,LMT组为(58±10)%,HMT组为(38±9)%,Veh组为(87±11)%;3.各组大鼠相应脑区的炎症因子检测结果显示,相较于Sham组,I/R组大鼠的TNF-α、IL-6和IL-1β的含量明显升高(P0.05或P0.01),相较于I/R组,HMT组的上述炎症因子含量明显降低(P0.05),三种所测炎症因子变化趋势相同;4.与Sham组相比,I/R、LMT、Veh组大鼠相应脑区的MDA和ROS水平明显升高,SOD活性明显降低(P0.05或P0.01),与I/R组相比,HMT组的MDA和ROS水平明显降低,SOD活性明显升高(P0.05);5.与Sham组相比,其余各组大鼠相应脑区的TLR4、MyD88、Cleaved Caspase-3、和NF-κB表达升高(P0.05或P0.01),与I/R组相比,LMT组和HMT组的上述各蛋白表达降低(P0.05或P0.01);6.荧光结果显示,TLR4和MyD88的变化趋势与小胶质细胞定位及活性变化一致,NF-κB的表达与神经元定位及活性变化一致。结论:1.小胶质细胞的TLR4/MyD88信号通路参与了肠缺血再灌注所致脑损伤;2.褪黑素能够通过抑制小胶质细胞TLR4/MyD88信号通路,发挥抗炎症、抗氧化及抗凋亡作用,从而对肠I/R所致脑损伤起到防治作用。
【学位单位】：西南医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R651.15
【部分图文】：

结 果1． 验证小肠缺血再灌注模型的建立夹闭 SMA 后，该动脉支配区域肠系膜动脉搏动消失，肠管颜色由鲜红变为苍白色。松开 SMA 开始灌注后动脉搏动恢复，缺血肠管变为紫红。再灌注 2 h 时，取 Sham 组和 I/R 组大鼠相同位置肠段行 H&E 染色，由两位西南医科大学附属医院病理科专业人员随机双盲观察所做小肠切片并进行 Chiu’s 评分。结果显示：Sham 组小肠绒毛形态结构完整，排列整齐，评分为 0.6±0.2 分；I/R 组小肠绒毛水肿，上皮细胞脱落，腺体损伤明显，固有层水肿、充血、出血，血管、淋巴管高度扩张，评分为 6.1±0.8 分。统计结果显示 I/R 组相较于 Sham 组有明显差异（t=14.91，P<0.01）。

图 3.水迷宫实验检测大鼠认知功能损害。A、B、C 图分别为术前各组大鼠的平均游泳距离、潜伏期以及游泳速度统计图；D、E、F 图分别为术后第 2 d 各组大鼠的游泳距离、潜伏期以及游泳速度统计图；G-I 图分别为 Sham 组、I/R 组、LMT 组、HMT 组、Veh 组术后第 2 d 逆转实验的游泳轨迹图。*P<0.05 vs. Sham 组；#P<0.05 vs. I/R 组。Figure 3. Cognitive impairment assessed by the Morris water maze test. A, the averageswimming distance of rats to platform during training days. B, latency to the platform duringtraining days. C, swimming speed during training days. D, swimming distance to platform at2 day after operation. E, latency to find the platform at 2 day after operation. F, swimmingspeed at 2 day after operation. Representative swim traces in reversal learning test: (G) Sham,(H) I/R, (I) LMT, (J) HMT, (K) Veh.*P<0.05 versus Sham group;#P<0.05 versus I/R group.4. 各组大鼠脑组织的炎症因子表达情况如图 4 所示，各组大鼠的额叶皮质和海马组织的 TNF-α、IL-6、IL-1β表达情况存在统计学差异（F=34.42，P<0.01；F=26.28，

图 4. 各组大鼠额叶皮质（A、B、C 图）和海马（D、E、F 图）的 TNF-α、IL-6、IL-1β 表达情况。*P<0.05，**P<0.01 vs. Sham 组；#P<0.05 vs. I/R 组。Figure 4. Changes of frontal cortex (A, B, C) and hippocampus (D, E, F) of tumornecrosis factor (TNF)-α, interleukin (IL)-6 and interleukin (IL)-1β in each groups. Data areexpressed as mean ± SD,*P<0.05,**P<0.01 versus Sham group;#P<0.05 versus I/R group.5. 各组大鼠的 MDA、SOD、ROS 的表达情况各组大鼠的额叶皮质和海马组织的 MDA、SOD、ROS 表达情况存在统计学差异（FMDA（皮质）=16.17，P<0.01；FMDA（海马）=11.34，P<0.05；FSOD（皮质）=43.93，P<0.01；FSOD（海马）=45.55，P<0.01；FROS（皮质）=116.1，P<0.01；FROS（海马）=133.9，P<0.01）。通过两两比较发现：与 Sham 组相比，I/R、LMT、Veh 组大鼠相应脑区的 MDA 和 ROS 水平明显升高，SOD 活性明显降低（P<0.05 或 P<0.01），与 I/R 组相比，HMT 组大鼠对应脑区的 MDA
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本文编号：2872062