金葡菌及SpA、PGN、LTA对破骨细胞分化的作用及其分子机制的研究

发布时间：2020-11-10 12:42

　　 [目的]研究金葡菌及其菌壁蛋白SpA、PGN、LTA对破骨细胞分化形成及骨吸收的作用,并探讨金葡菌、SpA、PGN、LTA促进破骨细胞分化形成的相关分子机制。[方法]1.MTT试验,将RAW264.7细胞种植于96孔细胞培养板,以不同感染复数的金葡菌活菌(5-40:1)、灭活菌(10-40:1),以及不同浓度的金葡菌滤液(5-20μg/ml)、SpA(50-1600ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于RAW264.7细胞,分别培养1、3、5天。在对应时间点,对相应的96孔板进行MTT试验,检测各刺激物对RAW264.7细胞增殖活性的影响。2.抗酒石酸酸性磷酸酶染色(TRAP染色),将RAW264.7细胞种植于96孔细胞培养板,以不同感染复数的金葡菌活菌(5-40:1)、灭活菌(10-40:1),以及不同浓度的金葡菌滤液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于RAW264.7细胞,在各刺激物作用后的第5天,对各实验组的96孔板进行TRAP染色,检测各实验组破骨样细胞的形成情况,并计数每孔破骨样细胞的数目。为研究NF-κB信号通路的作用,在各刺激物加入前1小时加入20μM的NF-κB转录活性抑制剂JSH-23,JSH-23共作用25小时后撤出,重复该部分实验。3.骨吸收凹陷实验,将RAW264.7细胞种植于24孔COAS骨吸收活性检测板上,以不同感染复数的金葡菌活菌(5-40:1)、灭活菌(10-40:1),以及不同浓度的金葡菌滤液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)、PGN(100-400ng/ml)、LTA(100-400ng/ml)作用于 RAW264.7 细胞,在各刺激物作用后的第5天,移除各实验组24孔COAS板内的培养基及细胞,检测各实验组骨吸收凹陷的形成情况,并在200倍镜的视野下,用软件计算各实验组骨吸收凹陷的累积面积占该视野面积的比值。为研究NF-κB信号通路的作用,在各刺激物加入前1小时加入20μM的JSH-23,重复该部分实验。4.实时荧光定量PCR(RT-PCR)实验,将RAW264.7细胞种植于6孔细胞培养板上,以不同感染复数的金葡菌活菌(5-40:1)、灭活菌(10-40:1),以及不同浓度的金葡菌滤液(5-20μg/ml)、SpA(50-800ng/ml)作用于RAW264.7细胞,在各刺激物作用后的第5天,使用RT-PCR检测破骨细胞标志性基因TRAP、MMP-9、cathepsin K、calcitonin receptors、Atp6v0d2的表达情况。为研究NF-κB信号通路的作用,在各刺激物加入前1小时加入20μM的JSH-23,重复该项实验。5.Western blot实验,将RAW264.7细胞传代培养于25cm2的细胞培养瓶内,待细胞生长并铺满瓶底约80%时,换液后分别以感染复数为20:1的金葡菌活菌、浓度为400ng/ml的SpA、200ng/ml 的 PGN 及 LTA,作用于 RAW264.7 细胞 0、5、10、20、40 及60分钟,在预定时间点收集细胞,通过westerrn blot方法检测ERK1/2、p38、JNK、NF-κB p65、IκB-α、Akt及其磷酸化蛋白的表达情况。为进行NFATc1的检测,将RAW264.7细胞接种于6孔细胞培养板,然后使用金葡菌、SpA、PGN及LTA对其进行诱导培养,金葡菌活菌感染RAW264.7细胞24小时后撤出,而400ng/ml的SpA、200ng/ml的PGN及LTA则持续作用于RAW264.7细胞,细胞分别培养0、1、2及3天,在对应时间点收集细胞,通过westernblot检测NFATcl的表达情况。为研究NF-κB与NFATc1的关系,在各刺激物加入前1小时加入20μM的JSH-23,重复该部分实验。6.酶联免疫吸附法(ELISA)实验,将RAW264.7细胞接种于24孔细胞培养板上,以感染复数为5-40:1的金葡菌活菌、50-800ng/ml的SpA、100-400ng/ml的PGN及LTA作用于RAW264.7细胞,细胞分别培养1、2、3天,在预定时间点收集上清液,通过ELISA检测IL-6、IL-1α及TNF-α的表达情况。[结果]1.MTT实验结果:金葡菌活菌在感染复数为5:1及10:1时,其对RAW264.7细胞的增殖活性无影响,在感染复数为20:1及40:1时,其抑制了RAW264.7细胞的增殖活性。SpA作用于RAW264.7细胞的第一天,在100-400ng/ml的浓度下,SpA促进了 RAW264.7细胞的增殖,在50及800ng/ml的浓度下,SpA对RAW264.7细胞的增殖活性无影响,但在1600ng/ml的浓度下,SpA抑制了 RAW264.7细胞的增殖;SpA作用于RAW264.7细胞的第3及第5天,在50-800ng/ml的浓度下,SpA对RAW264.7细胞的增殖活性无影响,但在1600ng/ml的浓度下,SpA抑制了 RAW264.7细胞的增殖。实验所用感染复数下的金葡菌灭活菌,以及实验所用浓度下的金葡菌滤液、PGN、LTA,对RAW264.7细胞的增殖活性无影响。2.TRAP染色结果,金葡菌活菌、灭活菌、金葡菌滤液、SpA、PGN及LTA均以剂量依赖的方式促进了破骨样细胞的形成,随上述刺激物剂量的逐步增加,破骨样细胞的形成数目逐渐增加。但在加入JSH-23后,上述各实验组破骨样细胞的形成数目明显降低,与相同剂量下未加入JSH-23的组比较,差异均有统计学意义。此外,在RANKL的存在下,SpA诱导形成的破骨细胞的数目明显增加,均高于相同浓度下未加入RANKL组所形成的数目。3.骨吸收凹陷实验结果,金葡菌活菌、灭活菌、金葡菌滤液、SpA、PGN及LTA均以剂量依赖的方式促进了骨吸收凹陷的形成,随上述刺激物剂量的逐步增加,骨吸收凹陷的面积逐渐增加。但在加入JSH-23后,上述各实验组骨吸收凹陷的面积明显降低,与相同剂量下未加入JSH-23的组比较,差异均有统计学意义。此外,在RANKL的存在下,SpA诱导形成的骨吸收凹陷的面积明显增加,均高于相同浓度下未加入RANKL组所形成的面积。4.PT-PCR实验结果,金葡菌活菌、灭活菌、金葡菌滤液及SpA均以剂量依赖的方式促进了破骨细胞标志性基因TRAP、MMP-9、cathepsin K、calcitonin receptors、Atp6v0d2 的表达增高,随上述刺激物作用剂量的逐步增加,破骨细胞标志性基因的表达逐渐增高。但在加入JSH-23后,上述各实验组破骨细胞标志性基因的表达均明显降低,与相同剂量下未加入JSH-23的组比较,差异均有统计学意义。此外,在RANKL的存在下,SpA诱导的破骨细胞标志性基因的表达,均高于相同浓度下未加入RANKL组所诱导的表达。5.Westem blot实验结果,在金葡菌活菌或SpA的作用下,IκB-α在其作用后的10min时表达明显降低,而磷酸化的NF-κB p65在5min及10min时表达增高。在PGN的作用下,IκB-α的表达在5min及lOmin时明显降低,而磷酸化的NF-κB p65在5min及10min时表达增高。在LTA的作用下,IκB-α的表达在5min及10min时降低,10min时降低更明显,而磷酸化的NF-κB p65在10min时表达明显增高。ERK1/2、p38、JNK、Akt及其磷酸化蛋白的表达,在金葡菌、SpA、PGN及LTA的作用下无明显变化。NFATcl的表达在金葡菌、SpA、PGN及LTA作用后的第2及第3天的表达逐渐增高,但加入JSH-23后,NFATc1在第2及第3天的表达明显低于未加入JSH-23时的表达。6.ELISA实验结果,在金葡菌感染下,IL-6、IL-1α及TNF-α在第2及第3天的表达,随金葡菌感染复数的增加及培养时间的延长,其表达逐渐增高。在SpA、PGN及LTA的作用下,IL-6在第2及第3天的表达随SpA、PGN及LTA浓度的增加及培养时间的延长,其表达逐渐增高,但IL-lα及TNF-α无明显表达。[结论]1.金葡菌具有促进破骨细胞分化形成及促进骨吸收的作用,该作用是金葡菌的菌壁成分及其分泌的活性分子的共同作用。2.金葡菌的菌壁蛋白SpA、PGN及LTA同样具有促进破骨细胞分化形成及促进骨吸收的作用。3.NF-κB信号通路在金葡菌、SpA、PGN及LTA诱导的破骨细胞的分化形成及骨吸收过程中起重要作用。
【学位单位】：昆明医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2017
【中图分类】：R681.2
【部分图文】：

１０｜ｉｇ／ｍｌ、２０ｐｇ／ｍｌ的金葡菌滤液，以及等体积的ＰＢＳ?（ｃｏｎｔｒｏｌ组）。对于金葡菌??活菌组，换液后加入无抗生素的培养基（１５％ＦＢＳ＋８５％的高糖ＤＭＥＭ），并在对??应孔内加入感染复数为５：１、１０：１、２０：１及４０：１的活菌（感染情况见图２），活菌??感染２４小时后使用抗生素（苯唑西林钠）将其灭活，并使用含苯唑西林钠的ＰＢＳ??溶液，漂洗各培养孔２－３遍后，使用完全培养基继续培养。添加刺激物后，细胞??分别培养１天、３天及５天；每２－３天换液一次，换液后重新加入金葡菌灭活菌、??金葡菌滤液及ＰＢＳ，活菌组不再进行重复感染，仅进行换液。在预定的培养时间??１７??

ＲＡＷ２６４．?７细胞分别培养１、３、５天后，感染复数为５：１及１０：１时，其??０Ｄ值与对照组比较，差异均无统计学意义；但感染复数为２０：１及４０：１时，其??０Ｄ值与对应时间点对照组的０Ｄ值比较，差异均有统计学意义（见图３）?＾感??染复数为２０：１及４０：１组的０Ｄ值均低于对照组的０Ｄ值，表明感染复数在５：１??及１０：１时，金葡菌对ＲＡＷ２６４．?７细胞的增值活性无影响；但感染复数在２０：１及??４０：１时，金葡菌活菌对ＲＡＷ２６４．?７细胞具有细胞毒性，抑制了其生长。??ＭＴＴ?ａｓｓａｙ??２?５?１?ｄａｙ?Ｅ３?３?ｄａｙｓ?ｍ?５?ｄａｙｓ??ｆ２－°－?ｎｉｌ?１１１１?ｊ?ｊ??＿＿??＾?＾??ｚ?／?／?／?／?／?／ＶＶＶ??ｙ?＾?＾?＾?＾?／?／??，，??２４??

金葡菌滤液１０｜ｉｇ／ｍｌ组（７１．９±４．２个／孔）、金葡菌滤液２０（ｉｇ／ｍｌ组（１５４．３±５．２??个／？Ｌ）。在相同感染复数及相同浓度下，与未加入ＪＳＨ－２３的对应组比较，差异??均有统计学意义（见图４－Ｄ），加入ＪＳＨ－２３后所形成的破骨样细胞的数目，均少??于未加入ＪＳＨ－２３的对应组所形成的破骨样细胞的数目。??＼?ｃｏｎｔｒｏｌ?Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?５：１??＿＿＿??Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?１０：１?Ｌｉｖｅ?Ｓ．ａｕｒｅｕｓ?ｍｏｉ?２０：１??ｍｄ?ｉ?ｍｉ??■…４．：销＇）??２６??
【参考文献】

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本文编号：2877939