HPC对大鼠颅脑创伤后SphK2的表达及神经细胞凋亡的影响

发布时间：2020-11-12 00:16

　　 颅脑创伤(Traumatic Brain Injury,TBI)致死率、致残率居高不下,从轻型到重型TBI均给患者和家属带来沉重的负担。战争时期,TBI是士兵伤亡类型中的主要形式,其具备表现的多样性、发展的迅速性、预后差异性等特点。TBI后会伴随着局部脑组织缺血、缺氧及血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的破坏最终会导致脑组织的水肿,而脑水肿又加重神经细胞缺血、缺氧的程度,形成恶性循。随着交通的发达,车祸所致的颅脑损伤也逐年增加,如何进一步提高TBI后患者的救治,将成为国内外神经外科医生研究的热点。相关研究表明,缺血预处理对维持BBB的完整通透性和减轻脑细胞水肿程度发挥作用,对改善其预后产生积极作用。缺氧预处理(Hypoxic Preconditioning,HPC)是指给予短时间单次或多次缺氧刺激后,可在机体各个组织内激发自身保护作用,在抗缺血、缺氧的神经保护功能上发挥作用;同时其具备安全、有效、可重复等特点。HPC对神经元细胞起到保护作用,维持BBB完整性从而减低了脑水肿发生的程度,目前关于HPC在TBI后干预脑细胞的重构与保护机理尚处在研究阶段,神外专科领域也少有报道。鞘氨醇激酶1(Sphingosine kinase 1,SphK1)是体内将鞘氨醇(sphingosine Sph)催化为1-磷酸鞘氨醇(Sphingosine 1-phosphate,S1P)的一种关键酶,SphK2因其催化活性以及细胞的特殊定位而影响着细胞内钙离子水平及神经细胞凋亡,在脑损伤后其表达的上调对脑神经细胞损伤起到保护作用~([1])。本实验旨在观察缺氧预处理(HPC)对于创伤性脑损伤大鼠脑组织中SphK2的表达变化以及对神经元细胞凋亡的影响,为TBI后患者成功的救治提供基础理论依据。第一部分创伤性脑损伤大鼠脑组织SphK2表达变化以及血脑屏障通透性变化的实验研究目的探讨创伤性脑损伤大鼠脑组织中鞘氨醇激酶2表达及血脑屏障(blood brain barrier,BBB)的变化规律。方法108只大鼠(成年雄性健康Sprague-Dawley大鼠)随机分组为创伤性脑损伤组(TBI组n=96)以及对照组(Con组n=12),采用改良的Feeney’s自由落体打击法建立大鼠创伤性脑损伤(TBI)模型。TBI组于伤后1h、4h、8h、12h、24h、3d、7d、14d断头处死。Con组仅做头皮切开缝合处理。分别应用逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、蛋白质印迹法(Western-Blotting)及免疫组化检测各组大鼠挫伤区周围皮层脑组织鞘氨醇激酶2的表达变化、干湿重法测脑组织含水量、免疫组化IgG法检测血脑屏障通透性变化情况。结果RT-PCR法检测SphK2 mRNA发现,在TBI后1h即开始表达,12h达到峰值状态,1d-14d呈下降趋势;伤后1h-7dTBI组表达较Con组明显增加,两组比较差异有统计学意义。Western-Blotting法检测蛋白情况发现,TBI组伤后1h开始出现SphK2蛋白表达,4h-12h呈上升趋势,伤后12h达峰值,1d-14天呈下降趋势。其中TBI组伤后1h-14d SphK2蛋白表达较Con组(0.18±0.10)明显增加,两组比较差异有统计学意义(P0.05)。IgG染色及免疫组化染色发现伤后1h出现阳性细胞表达,12小时黄染最为明显,伤后1d-14d染色逐渐变淡,干湿重法测脑细胞含水量发现,1h-1d呈上升趋势,3d达峰值,随后逐渐下降,伤后1h-7d TBI组与Con组脑组织水含量比较,差异具有统计学意义(P0.05),伤后14d两组比较,差异无统计学意义(P0.05)。结论大鼠遭受颅脑创伤后血脑屏障的完整性受到破坏,同时应激性的导致SphK2表达增加,SphK2表达增加可能在维持血脑屏障的完整性方面起重要作用。第二部分SphK-2参与缺氧预处理减轻大鼠颅脑创伤后神经细胞凋亡的实验研究目的探讨HPC对大鼠TBI后SphK2的表达及神经细胞凋亡的影响,研究HPC参与大鼠颅脑创伤后的脑保护机制。方法选取健康成年(S-D)大鼠204只,体重范围约260-290 g,均购于安徽医科大学实验动物中心,由实验室动物LAB精心管理喂养,大鼠均为健康成年大鼠(根据毛发判断),按科学标准精心饲养,定时、定餐、定量喂食水,大鼠生活环境为我院实验室多层铁笼装置,保持室内通风同时维持室温范围在23--25℃之间。采用随机数字法分成缺氧预处理后致颅脑创伤组(HPC组)96只及单纯TBI组96只,对照组(Con组)12只,其中HPC组和单纯TBI组分为伤后1h,4h,8h,12h,1d,3d,7d,14d 8个亚组,每个亚组12只。采用改良的Feeney’s方式(同前)制作TBI实验模型,将大鼠预先予以低压氧仓内训练3h/d,连续3d制作HPC动物模型,采用IgG法免疫组化染色、实时定量聚合酶链式反应(RT-PCR)及Western Blotting方法检测鞘氨醇激酶2(SphK2)基因及蛋白的表达、TUNEL法染色检测神经细胞凋亡的变化情况。结果(1)正常脑组织(con组)IgG无染色,TBI组脑外伤后1h即可见IgG轻微染色阳性细胞,伤后4h-8h染色逐渐变深,12h IgG黄染最明显,1d-14d呈下降趋势,伤后1h-7d HPC组IgG评分均低于TBI组,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。(2)RT-PCR及Western Blotting法检测结果显示,SphK-2在颅脑外伤后1h开始表达,4h-8h表达逐渐升高,12h到达峰值,1d-14d表达呈下降趋势,伤后1h-7d时间段SphK2 mRNA及蛋白表达HPC组比TBI组明显升高,两组比较差异具有统计学意义(P0.05))。(3)TUNEL染色检测神经细胞凋亡发现,单纯TBI组和HPC组于颅脑损伤后1d凋亡细胞开始表达,3d达最高峰,伤后3d-7d时间段呈下降趋势。神经细胞凋亡率HPC组较单纯TBI组明显减低,两组比较差异具有统计学意义(P0.05)。结论HPC显著增加大鼠脑损伤后Sphk2表达,降低神经细胞凋亡,从而发挥脑保护的作用。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R651.15
【文章目录】：
英文缩写对照表
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 创伤性脑损伤大鼠脑组织SphK2表达变化以及血脑屏障通透性变化的实验研究
    1 材料与方法
    2.相关实验结果
    3.讨论
    4.结论
第二部分 SphK2参与缺氧预处理减轻大鼠颅脑创伤后表达变化及神经细胞凋亡的实验研究
    1 材料与方法
    2.实验结果
    3.讨论
    4.结论
全文总结
参考文献
附录
致谢
综述
    参考文献

【参考文献】

相关期刊论文 前6条

1 Hui Xiao;Yang Yang;Ji-hui Xi;Zi-qian Chen;;Structural and functional connectivity in traumatic brain injury[J];Neural Regeneration Research;2015年12期

2 Min Ni;Xiao-Lei Shi;Zhi-Gang Qu;Hong Jiang;Zi-Qian Chen;Jun Hu;;Epithelial mesenchymal transition of non-small-cell lung cancer cells A549 induced by SPHK1[J];Asian Pacific Journal of Tropical Medicine;2015年02期

3 Jong Kuk Kim;Hye Jeong Lee;Hwan Tae Park;;Two faces of Schwann cell dedifferentiation in peripheral neurodegenerative diseases:pro-demyelinating and axon-preservative functions[J];Neural Regeneration Research;2014年22期

4 肖敏;吴显劲;蔡木发;易伟莲;;鞘氨醇激酶2抑制5-氟尿嘧啶诱导的人结肠癌HCT116细胞凋亡[J];第二军医大学学报;2014年10期

5 姚寅生;刘家传;杨艳艳;王金标;张永明;张星;王春琳;;缺氧预处理对创伤性脑损伤大鼠Claudin-5表达及血-脑屏障通透性的影响[J];中国微侵袭神经外科杂志;2014年04期

6 武孝刚;刘家传;杨艳艳;王金标;张永明;张星;王春琳;周治民;;缺氧预处理诱导创伤性脑损伤大鼠皮层组织HIF-1α及GLUT-1表达的影响[J];中华神经医学杂志;2014年04期

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1 覃琳;SphK1基因沉默对结肠癌RKO细胞化疗敏感性的影响[D];广西医科大学;2017年

本文编号：2879957