左氧氟沙星通过上调MMP-2和MMP-13促进大鼠椎间盘纤维环细胞凋亡

发布时间：2020-11-14 12:53

　　 目的:探讨左氧氟沙星诱导凋亡下大鼠纤维环细胞外基质和基质金属蛋白酶的变化。方法:酶消化法来原代培养大鼠的纤维环细胞,贴壁的细胞融合为单层后传代培养,传至第3代时,以不含胎牛血清以及酚红的DMEM/HIGH GLUCOSE(1×)培养液培养细胞,分别按照浓度依赖和时间依赖分组实验。浓度依赖组:按以下分组实验,每组为6个样本,对照组:以不含左氧氟沙星的培养液处理;10μg/ml组:加入浓度为10μg/ml的左氧氟沙星干预;30μg/ml组:加入浓度为30μg/ml的左氧氟沙星干预;60μg/ml组:加入浓度为60μg/ml的左氧氟沙星干预,90μg/ml组:加入浓度为90μg/ml的左氧氟沙星干预;120μg/ml组:加入浓度为120μg/ml的左氧氟沙星干预,以上各组细胞培养24小时。时间依赖组:按以下分组实验,每组为6个样本,对照组:加入浓度为60μg/ml的左氧氟沙星干预0小时;8小时组:加入浓度为60μg/ml的左氧氟沙星干预8小时;12小时组:加入浓度为60μg/ml的左氧氟沙星干预12小时;24小时组:加入浓度为60μg/ml的左氧氟沙星干预24小时,36小时组:加入浓度为60μg/ml的左氧氟沙星干预36小时;48小时组:加入浓度为60μg/ml的左氧氟沙星干预48小时。两组实验分别应用:1应用倒置相差显微镜来观察大鼠的纤维环细胞形态;2 caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3的活性;3细胞-胶原粘附实验检测细胞与Ⅰ型胶原的粘附水平;4用实时定量PCR法来检测纤维环细胞中的MMP-2和MMP-13蛋白相关基因表达情况;5 western印迹法对MMP-2蛋白和MMP-13蛋白定量检测。结果:1原代大鼠纤维环细胞多数呈现为长梭形,且轮廓明显,细胞核呈现出圆形以及椭圆形,24~48小时后细胞可贴壁生长,8~9天细胞即进入其对数生长期。经不同浓度左氧氟沙星干预24小时和60μg/ml的左氧氟沙星干预不同时间后观察细胞出现细胞皱缩、空泡形成等凋亡征象;2用caspase-3活性检测试剂盒(碧云天)来检测细胞中caspase-3的活性,结果显示在浓度依次为10μg/ml、30μg/ml、60μg/ml、90μg/ml、120μg/ml左氧氟沙星干预24小时后,细胞caspase-3的活性分别为对照组的1.81倍、3.22倍、4.23倍、5.54倍、6.56倍,差异具有统计学意义。在左氧氟沙星(60μg/ml)依次干预0、8、12、24、36、48小时后,细胞caspase-3的活性分别为对照组的1.54倍、2.98倍、4.18倍、5.30倍、6.40倍,差异具有统计学意义(P0.05);3细胞与Ⅰ型胶原的粘附水平实验,浓度依赖组中各组OD值分别为对照组的0.91倍、0.83倍、0.76倍、0.70倍、0.60倍,差异具有统计学意义。时间依赖组中各组OD值分别为对照组的0.91倍、0.82倍、0.75倍、0.67倍、0.61倍,差异具有统计学意义(P0.05);4实时定量PCR检测,在浓度依赖组:MMP-2和MMP-13的2-△△Ct值分别为1.02±0.22、1.38±0.19、1.71±0.25、2.04±0.22、2.50±0.18、3.24±0.38;1.00±0.06、1.37±0.09、1.75±0.15、2.48±0.18、3.09±0.28、3.70±0.31,差异都具有统计学意义(P0.05)。在时间依赖组:MMP-2的2-△△Ct值分别为1.01±0.15、1.23±0.11、1.64±0.21、2.07±0.38、3.05±0.15、3.53±0.22,对照组和8h组间无统计学差异(P0.05),其余各组差异具有统计学意义(P0.05);MMP-13的2-△△Ct值分别为1.01±0.13、1.33±0.17、1.88±0.32、2.54±0.48、3.18±0.47、3.84±0.46,对照组和8h组间无统计学差异(P0.05),其余各组差异具有统计学意义(P0.05);5用western印迹法来检测大鼠纤维环细胞中MMP-2和MMP-13蛋白的表达。结果显示:在浓度依赖组:MMP-2和MMP-13的灰度值(/GAPDH)分别为0.12±0.012、0.20±0.017、0.31±0.018、0.42±0.022、0.51±0.021、0.60±0.025;0.17±0.018、0.28±0.020、0.39±0.023、0.46±0.023、0.57±0.027、0.68±0.031。在时间依赖组:MMP-2和MMP-13的灰度值(/GAPDH)分别为0.10±0.012、0.19±0.023、0.32±0.027、0.41±0.027、0.52±0.031、0.65±0.035;0.16±0.019、0.26±0.024、0.35±0.023、0.48±0.027、0.57±0.031、0.66±0.040。在浓度依赖组和时间依赖组MMP-2和MMP-13的表达量差异都具有统计学意义(P0.05)。结论:上述研究表明,左氧氟沙星对大鼠纤维环细胞的体外细胞毒作用的可能归因于降低细胞与Ⅰ型胶原粘附能力和影响MMP-2和MMP-13表达。
【学位单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R681.53
【部分图文】：

A B图 1 倒置相差显微镜观察。（A）以不含胎牛血清以及酚红的 DMEM/F12 培养液培养纤维环细胞，并且加入剂量为 0 至 120μg/mL 的左氧氟沙星干预 24 小时。（B）以不含胎牛血清以及酚红的 DMEM/F12 培养液培养纤维环细胞，并且加入剂量为 60μg/mL 的左氧氟沙星干预 0 至 48 小时Fig. 1 Morphological observation. (A) AF cells cultured in serum-free DMEM/F12 with 0 to 120 μg/mL levofloxacin for24 h. (B)AF cells cultured in serum-free DMEM/F12 with 60 μg/mL levofloxacin for 0 to 48 h. Apoptotic cells werecharacterized by plasma membrane blebbing, cell shrinkage and nuclei condensingand

A BAB图 1 倒置相差显微镜观察。（A）以不含胎牛血清以及酚红的 DMEM/F12 培养液培养纤维环细胞，并且加入剂量为 0 至 120μg/mL 的左氧氟沙星干预 24 小时。（B）以不含胎牛血清以及酚红的 DMEM/F12 培养液培养纤维环细胞，并且加入剂量为 60μg/mL 的左氧氟沙星干预 0 至 48 小时Fig. 1 Morphological observation. (A) AF cells cultured in serum-free DMEM/F12 with 0 to 120 μg/mL levofloxacin for24 h. (B)AF cells cultured in serum-free DMEM/F12 with 60 μg/mL levofloxacin for 0 to 48 h. Apoptotic cells werecharacterized by plasma membrane blebbing, cell shrinkage and nuclei condensingand图 2 左氧氟沙星上调 MMP-2 和 MMP-13 蛋白表达。纤维环细胞处理同前，用蛋白免疫印迹法分析 MMP-2 和MMP-13 蛋白表达。（A）左氧氟沙星以剂量依赖方式上调 MMP-2 蛋白表达，影响 MMP-13 蛋白表达。（B）左氧
【参考文献】

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1 流小舟;徐海栋;周光新;赵建宁;;椎间盘退变中基质金属蛋白酶作用的研究进展[J];医学研究生学报;2015年11期

本文编号：2883499