游离脂肪酸与红细胞损伤的相关性研究

发布时间：2020-11-14 13:41

　　 研究背景髋膝关节置换术中及术后出血是常见的手术并发症。然而,关节置换术后可见到一种由于隐性失血(Hidden Blood Loss, HBL)造成的贫血,这种隐性失血量的计算是根据Gross方程,在总失血量中减去可见失血量得出的。有研究报道THA围手术期隐性失血量占总失血量的30%,在一组髋部骨折的病例研究中发现纠正脱水造成的偏倚后,计算隐性失血量达到547 ml-1473 ml,但其发生机制尚不清楚。由于在止血带的使用,全膝关节置换(Total knee arthroplasty, TKA)术中出血量非常小,可以忽略不计。TKA围手术期显性出血量可以约等于术中出血与术后关节腔血液引流量之和。理论上讲,回收引流的血液并回输病人是足以纠正围手术期失血的状况的。但研究发现,关节置换术后自体血回输并不足以纠正术后出现的贫血,回收量即回输血量仅相当于总失血量的50%(根据术前术后红细胞压积,使用Gross方程计算得出)。这种不明原因的血红蛋白下降就是所谓的隐性失血,这种隐形失血往往导致病人有时需要接受血库输血。虽然不止一种理论试图解释隐性失血的机理,但似乎都不成功。Pattison推测术后隐性失血至少部分是溶血的结果,但溶血的原因并不清楚。Faris发现血液自体回输会造成溶血,研究中发现平均自体回输1.3 L,血浆中血红蛋白水平达到50 mg/L。由于结合珠蛋白的存在,该水平的溶血不足以造成血红蛋白尿,但可造成自体回输血量不足。我们现在知道,正常人血浆中Hb的水平基本就在50 mg/L左右。而且Shen的研究证明自体血回输组与非输血组之间在HBL上无显著性差异。值得注意的是,Li报道止血带的使用是造成HBL的可能原因,该研究显示未使用止血带病人的HBL较使用者低16%,但HBL的绝对值仍达到600ml。除此之外,“第三间室”理论也试图对这一现象做出解释。Erskine使用标记的红细胞发现难以解释的失血是由于血液进入周围组织间隙的原因。然而TKA术后通常使用加压包扎和负压吸引装置,很难相信血液会渗入高压力的软组织间隙,而非负压力的吸引装置中。尽管有如此多的理论假说,隐性失血的病理机制仍需更多的研究去探讨。研究发现游离脂肪酸(Free fatty acid, FFA)可在中性粒细胞内强烈诱导氧自由基(reactive oxygen species, ROS)如超氧阴离子(02-)及其代谢产物,如过氧化氢和次氯酸的产生。过度生成的氧化物在血液中可氧化红细胞膜表面的多不饱和脂肪酸和胞浆内的血红蛋白HB,导致红细胞渗透脆性增加,造成Hb变性。另一方面,根据Guard提出的脂肪栓塞综合征(Fatty Embolism syndrome, FES)的诊断标准,难以解释的红细胞压积降低是其次要标准之一。而且不明原因的贫血也常早于典型的肺部和脑部症状的出现。值得注意的是,FES与髋膝关节置换的共同特点是血液中的脂肪小滴会明显增加。TKA术中插入股骨髓腔用于定位截骨板的导向杆以及THA术中打入股骨髓腔的髓腔挫和股骨柄假体均会造成髓腔压力增高。后者在髓腔内脂肪小滴通过血循环进入心、脑、肺等器官的病理过程中起重要作用,这一点通过TEE已得到证实。同时也有临床证据表明心肺功能异常与栓塞事件之间有密切相关性。除了在这些器官中机械阻塞毛细血管,脂肪小滴的代谢产物游离脂肪酸还能通过刺激中性粒细胞产生活性氧簇ROS,进而损伤红细胞。ROS常生成于两条途径：一是线粒体途径,ROS主要产生于线粒体呼吸链内的Ⅰ和Ⅲ复合体,第Ⅱ复合体中的α磷酸甘油脱氢酶mGPH和柠檬酸循环和α酮戊二酸脱氢酶在线粒体产生ROS的过程中也发挥了一定作用；二是非线粒体途径中,在内质网和细胞色素P450单氧化物酶的作用下发生的PUFA代谢转化是ROS生成的主要原因。另外,NADPH的氧化也有助于ROS的生成。线粒体途径ROS的产生速度主要依赖于供电子的偶联部位、复合体Ⅰ和Ⅲ质子泵的效率。复合体内FMN、Fe-S簇和Q结合域以及跨膜电位的水平决定了跨线粒体膜的电子流速,进而控制了ROS的产生。正向和反向电子传递也影响了ROS的产生速度,长链FFA及其代谢产物可促进线粒体途径ROS的产生。FFA通过与复合体Ⅰ和Ⅲ的亚基结合降低正向电子传递的电子流,进而加快ROS的生成。FFA还可通过以下途径刺激ROS的生成：a.作为质子载体,FFA降低了ROS生成对反向电子传递的依赖；b.通过调节酶复合体,FFA抑制GSSG向还原型谷胱甘肽GSH转化,从而减慢谷胱甘肽过氧化物酶清理过氧化氢的速度；c.FFA对线粒体内膜的高亲和性对膜的流动性会产生损害。另一方面,FFA也是中性粒细胞中NADPH氧化酶依赖的超氧化物生成的刺激物,属于非线粒体途径。线粒体内生成的02-在基质区和胞浆区分别受Mn-超氧化物歧化酶Mn-SOD和ZnCu-SOD的作用转化为过氧化氢。后者受过氧化氢酶的作用转化H20和02,或经谷胱甘肽作用转化为H2O。除此之外,过氧化氢在中性粒细胞内也可受髓过氧化物酶的作用转化为次氯酸HOCL。中性粒细胞通过产生ROS清除病原体和异物。生理情况下,氧化和还原过程处于平衡状态,这对于细胞和器官的生存有着重要作用。然而ROS的过度生成会损害含有大量多不饱和脂肪酸PUFA的细胞膜。过氧化物氧化还原酶-2广泛存在于红细胞膜上,保护红细胞免受氧化损害,但研究显示5uM的过氧化氢就可完全氧化该酶。血红蛋白氧化损伤表现为其结构和功能的改变,导致变性和沉淀以及高铁血红蛋白的产生。亲水的过氧化氢还可穿透细胞膜直接氧化血红蛋白而产生ferryl血红蛋白(ferryl Hb),后者不但丧失携氧能力,而且其自发还原为亚铁血红蛋白的过程非常缓慢,甚至无法恢复到正常的状态。红细胞中的次氯酸氧化谷胱甘肽和膜蛋白SH组,增加细胞渗透脆性并通过脂质氧化损害细胞变形能力。有研究证实次氯酸对红细胞的的氧化作用使得后者对Stichodactyla heliantus Ⅱ的溶血诱导效应更加敏感。因而推测,行膝关节置换时骨髓腔压力异常增高,髓腔内脂肪小滴进入血循环(这一点已被术中经食道超声证实),脂肪小滴的代谢产物游离脂肪酸,可刺激中性粒细胞产生过氧化氢和次氯酸,后两者可氧化耗竭红细胞膜表面的超氧化物歧化酶SOD、谷胱甘肽过氧化物酶以及总抗氧化能力TDC,同时造成血红蛋白氧化变性。受损的红细胞膜及其渗透脆性的升高,并失去携氧能力的ferryl血红蛋白是贫血的主要原因。同时我们也提出,FES过程中难以解释的贫血也是由于FFA的氧化应激诱导活性造成的,这一点与髋膝关节置换术后隐性失血的机制一致。目的研究游离脂肪酸对大鼠血液中红细胞及血红蛋白的影响,探讨隐性失血的发病机制。方法将实验分为两个部分,分别通过尾静脉向大鼠体内注入不同浓度的游离脂肪酸替代物亚油酸、花生四烯酸,构建活体内高游离脂肪酸水平模型,对变化显著的实验组作进一步分析研究,检测血液中红细胞和氧化还原剂的变化情况。分别在给药前及给药24、48、72小时后采集血液样本,测定血红蛋白(hemoglobin, Hb)、红细胞计数(red blood cell count, RBC)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-PX)活力、超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase, T-SOD)活力、过氧化氢(hydrogen peroxide, H2O2)的含量变化以及ferryl Hb生成情况；同时通过显微镜观察红细胞形态学动态变化情况。结果两部分实验的结果变化趋势一致,均成功构建了隐性失血动物模型。给药24小时后,实验组与对照组相比Hb含量和RBC都降低,且各实验组均比对照组变化更显著(p0.05)；同时,实验组与对照组相比GSH-PX活力、T-SOD活力、H202含量也都明显降低(p0.05)。给药48小时后,对照组血液中Hb含量及RBC无明显变化,而亚油酸组、花生四烯酸组仍有明显下降(p0.01)；实验组GSH-PX活力、T-SOD活力、H202含量均明显持续下降(p0.01)。各实验组红细胞形态在给药后24、48小时后均出现病理性变化,主要变现为红细胞形态的多形性、细胞壁皱缩甚至细胞破裂坏死。同时研究发现,各实验组在给药后24、48小时样本吸光值显著升高,以给药后24小时吸光值最高,并且吸光值在425nm处达到峰值,符合ferryl血红蛋白特性；在给药而在72小时之后,血液中RBC、Hb含量相对稳定,GSH-PX活力、T-SOD活力、H2O2含量也逐渐回升趋于平衡状态。结论高浓度的亚油酸及花生四烯酸均能导致红细胞的急性损伤,其病理机制是游离脂肪酸诱导的应激性氧化还原反应,能氧化破坏红细胞及血红蛋白,从而引发隐性失血。
【学位单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：R687.4
【部分图文】：

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５００?ｎｍ处。研究的结果表明在给药后２４、４８小时吸光值均在４２５ｍｎ处出??现峰值，Ｗ给药后２４小时最为明显，给药后７２小时与给药前相比无明显??变化（图２－６）。结果表明ＬＩＮ－Ｃ组吸光值与ｆｅ＾ｙｌＨｂ标准品变化趋势一??致，其峰值的出现及吻合可认为实验组样本中有ｆｅｒｒｙｌ?Ｈｂ的存在。??１９??
【参考文献】

相关期刊论文 前1条

1 王雪艳;匡洪宇;;糖尿病与糖尿病肾病患者氧化应激状态的分析[J];齐齐哈尔医学院学报;2008年06期

本文编号：2883533