人类主动脉瓣膜组织特异性circRNAs基因位点检测及功能分析研究

发布时间：2020-11-15 13:44

　　 背景和目的主动脉瓣疾病,在临床上比较常见。需要手术干预的主动脉瓣疾病中,钙化性主动脉瓣疾病和二叶式主动脉疾病所占比例越来越高,并且目前还没有找到预防和阻止主动脉疾病发生和进展的有效方法。面对这个困境,越来越多的研究者将目光转向疾病的分子机制的研究上。最近,环状RNA(Circular RNAs,circRNAs),一类独特的具有共价闭合连续环的RNA,已经成为一个新的研究热点。物种的丰富性和进化保守性表明环状RNA可能在细胞生理学中扮演了特殊的角色。本研究旨在对主动脉瓣的转录组进行分析,以利于探索预防和阻止主动脉瓣疾病发生和进展的方法。材料和方法我们收集了江苏省人民医院心脏大血管外科手术切除的两个钙化的人主动脉瓣膜,一个来自二叶式主动脉瓣病人,另一个来自三叶式主动脉病人。先进行文本库准备和高通量序列建立,然后对测得的数据进行RNA测序技术(RNA Sequencing,RNA-Seq)分析、组织特异性circRNAs的鉴定、序列的进化保守性分析和circRNAs宿主基因的基因本体(Gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析。结果从这两个主动脉瓣样本中提取了所有的RNA,并为每个样本各构建了一个去除核糖体的文库。每个样本通过高通量测序都产生了一个平均1.12亿个双末端(Pair-end,PE)序列。使用内管道技术测得主动脉瓣含有5476个高度可信的人主动脉瓣circRNAs。并与在人类主动脉瓣测得的circRNAs和从circNet数据库、circBase数据库和TSCD数据库下载的所有其他circRNAs进行比对,共检测出1412(25.79%)个人类主动脉瓣特异性circRNAs。然后,通过内部脚本,获得了4132个成熟的主动脉瓣特异性circRNAs异构体,这其中包括1561个全部外显子circRNAs亚型、2378个部分内含子侧翼亚型、115个全部内含子亚型和78个基因间区亚型。在3060个circRNAs亚型中存在194471个微RNA(microRNAs,miRNA)分子海绵元件,平均每个circRNA有64个miRNA靶点。大约512(16.7%)个circRNAs亚型拥有一百个以上的靶点,并且所有这些circRNAs亚型都来自于基因间区或内含子侧翼。宿主基因chr10:61,815,416|61,898,845是锚定蛋白3(ANK3),它编码锚蛋白家族ankyrin-G蛋白,而且ANK3蛋白质还与心脏钠通道基因SCN5A有关。这两种蛋白质都在心室闰盘和心肌细胞T小管膜中呈现高度表达。这些结果表明外显子circRNA chr10:61,815,416|61,898,845可能参与了心脏传导过程,而这种circRNA可能起到的就是miRNA分子海绵作用。我们从STARBASE V2.0下载了CLIP-Seq数据集,其中包括37个RNA结合蛋白(RNA binding protein,RBP)。RBP的计算分析表明,有734个circRNAs亚型与RBP序列有互补作用,其中RBP EIF4AIII表现的最为丰富。我们还观察到Argonaute(AGO)家族成员AGO2在这些组织特异性circRNAs中具有丰富的结合位点。结论1,在人的主动脉瓣膜中共检测出5476个circRNAs,其中包括1412个(25.79%)主动脉瓣组织特异性circRNAs。2,大多数的主动脉瓣特异性circRNAs都来自于它们宿主基因的外显子区,而宿主基因中大多数包含少于三个circRNAs。3,大多数主动脉瓣特异性circRNAs都有丰富的miRNA应答元件(miRNA reaction elements,MREs),而且一些主动脉瓣特异性circRNAs可能倾向于结合RNA结合蛋白。功能分析显示,这些主动脉瓣特异性circRNAs可作为转录后调节因子。
【学位单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R654.2
【部分图文】：

ㄖ鞫?霭曜橹?匾煨?circRNAs 的 RNA-seq 数据库流程图1）获取主动脉特异性 circRNAs为了获得主动脉瓣特异性 circRNAs，我们从组织特异性环状 RNA 研究数据库TSCD (Tissue-Specific CircRNA Database:http://gb.whu.edu.cn/TSCD) 下载了其他 16 个成人人体组织的组织特异性 circRNAs 和 15 个人类胎儿组织特异性circRNAs【23】。我们还收集了来自 circNet 和 circBase 数据库的人类组织或细胞系的所有已发表的 circRNAs 数据【24-25】。circBase 网站（http://circrna.org/），CircNet数据库数据来源基于转录测序结果，并进一步联合 microRNA 等信息进行了整合

南京医科大学博士学位论文结果1， 样本收集收集江苏省人民医院心脏大血管外科进行心脏外科手术的患者的主动脉瓣膜组织。两个标本均为钙化的人主动脉瓣膜，一个来自 BAV 的重度主动脉瓣狭窄病人，另一个来自 TAV 的中重度主动脉瓣关闭不全病人。2， 主动脉瓣病理形态

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本文编号：2884822