米诺环素多功能纳米给药系统的脊髓损伤靶向治疗研究

发布时间：2020-11-22 01:15

　　 脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)是脊椎疾病中最常见的致残致死性损伤,严重影响了患者及其家庭的生活质量,且随经济水平的飞速发展,发病率呈逐年上升的趋势。目前,临床上SCI的治疗手段非常有限,主要通过手术以解除脊髓压迫,并用糖皮质激素进行冲击治疗以抑制SCI后的炎症反应,但糖皮质激素治疗窗较窄,治疗效果有限,且毒副作用严重,其临床应用存在很大争议。近年来,随着人们对SCI认识的逐渐深入,细胞移植、组织工程等新型治疗方式不断取得新进展。细胞移植可替换丢失的神经组织,组织工程可作为桥梁以修复脊髓缺损,促进脊髓再生,但这两种方式均易造成脊髓二次损伤,且对SCI后的继发性损伤基本无抑制作用,可能对神经恢复和运动学功能改善情况有限。能够同时抑制继发性损伤并促进神经再生或修复的多靶点治疗方式可能是SCI治疗的有效策略。盐酸米诺环素(minocycline hydrochloride,MC.HC1)是一种广谱的四环素类抗生素,具有抗炎、抗氧化和抗凋亡活性,能够抑制继发性损伤并发挥神经保护作用,可显著改善SCI模型动物的行为学功能,Ⅱ期临床试验结果也初步表明MC.HC1在SCI患者中有改善运动功能的疗效。但因其给药剂量较大,并需长时间给药,易导致肝肾毒性。新型纳米给药系统是改善药物体内分布,降低药物毒副作用的有效手段,且可通过载体材料的功能化实现SCI的多靶点治疗。本研究以米诺环素为模型药物,分别以能促进神经再生及修复的多聚唾液酸和具有神经保护作用的聚乙二醇为亲水性聚合物,构建纳米靶向给药系统,实现药物的靶向递送和SCI的多靶点治疗。多聚唾液酸(polysialic acid,PSA)是一种位于细胞表面的内源性碳水化合物,在细胞迁移、神经系统发育、突触形成、神经系统受损后的修复和神经再生中起重要作用,且有利于轴突的长距离生长,本研究以PSA为亲水性聚合物,利用PSA上游离羧基与硬脂胺(octadecylamine,ODA)上氨基间的酰胺反应,对PSA进行疏水性修饰,得到多聚唾液酸-硬脂胺嫁接物(PSA-ODA,PSO),用于负载米诺环素,并通过控制ODA的投料比,得到不同ODA取代度的PSO。嫁接物能够在水性介质中自组装形成胶束,当ODA投料比从5%增加至20%时,嫁接物临界胶束浓度(critical micelle concentration,CMC)从 126.1 降低至 37.3μg/mL,胶束粒径从149.00±7.21减小至84.40±8.42nm;ODA投料比为10%和20%得到的PSO嫁接物均能有效负载米诺环素(minocycline,MC),包封率均在70%以上,载药量可达12%,体外释放结果显示负载MC的PSO嫁接物载药胶束(PSM)药物释放可持续至72 h,但ODA投料比为20%得到的PSM胶束药物释放较慢,不利于SCI的治疗,因此选用ODA投料比为10%得到的PSO嫁接物进行后续实验。以BV2细胞和原代培养的小胶质细胞为模型,考察PSO嫁接物的细胞毒性和细胞内在化能力,结果表明细胞与1-1000 μg/mLPSO共孵育48h后,细胞存活率均在90%以上,表明嫁接物具有低细胞毒性,且PSO嫁接物能较快地被两种细胞摄取,摄取呈时间依赖性;采用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BV2细胞和原代小胶质细胞,构建炎症细胞模型,以MC.HC1为阳性对照,考察PSM的抗炎作用,结果表明炎症细胞与PSM共孵育后,TNF-α,IL-6和NO的释放量明显降低,iNOS和Iba-1的表达也明显下调,且与MC.HC1组相比,无明显差异;以SH-SY5Y细胞为模型细胞,采用H2O2刺激构建体外神经细胞受损模型,考察PSM的神经保护作用,结果表明H2O2刺激SH-SY5Y细胞经PSM预处理后,细胞内钙离子浓度降低,细胞存活率和活细胞数目明显增加,凋亡和坏死比例降低,且PSM神经保护作用与MC.HCl相当,PSO嫁接物胶束基本无抗炎和神经保护作用。以雌性SD大鼠为模型动物,采用重物坠落法建立SCI模型,PSO嫁接物胶束经静脉给药后可有效分布至脊髓受损部位,且在脊髓组织白质和灰质中均匀分布。MC.HC1和PSM经尾静脉注射给药24h后,与Saline组相比,脊髓受损部位TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA和NO的浓度显著降低,SOD酶的活力明显增强,iNOS蛋白表达有显著下降,细胞凋亡明显减少,继发性损伤得到有效抑制,PSM组与MC.HC1组相比,无明显差异。MC.HCl、PSM和PSO连续给药7d后,采用Basso-Beattle-Bresnahan(BBB)评分法考察大鼠后肢的运动学功能,结果表明在术后12w的观察周期内,与Saline组相比,MC.HCl、PSM和PSO组大鼠后肢的运动学功能明显改善,其中PSM改善效果明显优于MC.HC1和PSO组;术后12w,采用核磁共振仪、皮质脊髓束顺行示踪技术和免疫荧光等方法考察不同治疗方法对脊髓组织的改善作用和不同组脊髓组织的病理学变化,结果表明MC.HC1、PSM和PSO能显著减小脊髓受损部位的空洞面积,增加BDA阳性染色神经纤维数目,明显改善损伤所致的脱髓鞘病变、显著减少胶质瘢痕的形成和轴突的坏死;与MC.HCl和PSO组相比,PSM组呈现更好的治疗效果,轴突能长距离生长并与尾侧组织重新建立连接。此外,术后4 w,在PSM组脊髓受损部位可明显观察到神经元的再生,可能原因为药物可通过抑制继发性损伤,为神经再生提供合适的微环境,而PSA能促进神经干细胞和神经前体细胞的分裂和增殖,从而使再生神经元数目明显增加。MC.HC1连续给药7d后,血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶、血肌酐和尿素氮的浓度显著升高,对肝肾均有一定毒性,PSO和PSM组生化指标与正常组接近,结果表明PSO嫁接物及构建的载药胶束安全性较高。聚乙二醇(polyethyleneglycol,PEG)作为膜封闭剂,可通过修复受损的细胞膜、细胞器膜和轴突膜减少钙离子内流,维持细胞正常功能并修复变性轴突,减少由继发性损伤导致的细胞坏死和凋亡,发挥神经保护作用。本研究在前期研究的基础上,以两端羧基化的PEG为亲水性聚合物,利用PEG上羧基与聚-(乳酸-羟基乙酸)(poly-(lactic-co-glycolic acid),PLGA)和唾液酸(sialic acid,SA)上羟基间的酯化反应对PEG进行疏水性和靶向修饰,合成得到SA修饰的PEG-PLGA(PP)共聚物(SAPP);PP和SAPP共聚物的CMC分别为14.40 ± 2.32和18.78 ± 3.28μg/mL,且PP和SAPP胶束均能有效负载MC,包封率在65%以上;体外释放结果显示,载药胶束(PPM和SAPPM)呈现明显的缓释特征,体外释放时间超过72 h,累积释放百分率可达85%左右;SA修饰对空白共聚物胶束和载药胶束的粒径、电位、胶束形态、载药量、包封率和药物释放基本无影响。以BV2细胞为模型,考察PP和SAPP的细胞毒性和细胞内在化能力,结果表明PP和SAPP细胞毒性低,且均能被BV2细胞较快摄取,摄取呈时间依赖性;PPM、SAPPM和MC.HCl在LPS刺激的BV2细胞上抗炎效果相当,而PP和SAPP基本无抗炎活性;以SH-SY5Y为模型细胞,采用谷氨酸(glutamate,Glu)构建体外兴奋性中毒神经细胞模型,考察PEG和MC.HCl的神经保护作用,结果表明Glu刺激SH-SY5Y细胞经MC.HCl、PPM、SAPPM、PP和SAPP预处理后,细胞内钙离子浓度降低,细胞存活率增加,凋亡比例降低,且由于PEG和MC的协同作用,使得PPM和SAPPM对神经细胞的保护作用优于其他组,PPM和SAPPM组间无显著性差异。以HUVEC为模型细胞,采用LPS刺激模拟SCI后损伤部位的炎症血管内皮细胞,考察细胞对SAPP的摄取。结果表明细胞经LPS刺激后,E-选择素受体表达明显上调,SAPP可通过与E-选择素受体的特异性结合靶向性地被LPS刺激的HUVEC细胞摄取,且E-选择素受体被游离SA部分阻断后,细胞对SAPP的摄取减弱。以SCI大鼠为模型,考察SAPP在模型动物体内各组织脏器的分布和在脊髓组织中的经时分布,结果表明SCI模型动物损伤部位E-选择素受体的表达明显增加,SAPP可通过与E-选择素受体的特异性结合,实现脊髓受损部位的靶向分布,经尾静脉注射12 h后分布最多,且单位质量脊髓组织内的荧光强度高于肝脏,具有良好的靶向性。以SCI大鼠为模型动物,MC.HC1、PPM和SAPPM经尾静脉注射给药24 h后,脊髓受损部位TNF-α、IL-6、IL-1β、MDA和NO的浓度显著降低,SOD酶活力明显增强,iNOS和caspase-3蛋白表达显著降低,继发性损伤得到有效抑制,其中,SAPPM对继发性损伤的抑制作用明显优于PPM组,与MC.HCl组相比,则无显著差异。MC.HC1、PPM、SAPPM、PP和SAPP连续给药7d后,在术后12w的观察周期内,大鼠后肢的运动学功能明显改善。术后12 w,采用核磁共振仪、免疫荧光等方法考察不同组大学脊髓组织的病理学变化,结果表明不同治疗方法均能显著减小脊髓受损部位的空洞面积,改善损伤所致的脱髓鞘病变和减少轴突的坏死,SAPPM组改善效果最明显;术后12 w,MC.HC1和PPM组大鼠肝肾组织可见明显病变,表明MC.HCl和PPM对肝肾均有一定毒性,PP、SAPP和SAPPM组大鼠各组织脏器均无可见病变,结果表明PP、SAPP和SAPPM安全性较高。本研究构建的两种功能性米诺环素递药系统均能通过药物向脊髓受损部位的靶向递送,实现继发性损伤的有效抑制,同时,残留的PSA可促进神经的再生及修复,PEG可发挥神经保护作用,通过药物和载体的协同作用,实现SCI的安全高效治疗,为SCI治疗方法提供新策略和新思路。
【学位单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R651.2
【部分图文】：

１．３．２．１空白嫁接物胶束及负载米诺环素的嫁接物载药胶束的粒径分布和形态观察??当ＯＤＡ投料比为１０％得到的ＰＳＯ嫁接物的浓度为１?ｍｇ／ｍＬ时，空白胶束??（ＰＳＯ）和载药胶束（ＰＳＭ）的粒径分布和形态如图１．４所示。结果表明：与空白??胶束相比，载药后粒径减小，可能是因为药物与疏水内核间的相互作用使胶束的疏??水内核结合更加紧密；ＴＥＭ图片显示的空白和载药胶束的粒径均略小于动态光散??射法测到的水合粒径，可能原因为在制备透射电镜样品过程中，亲水性外壳发生皱??缩；ＰＳＯ和ＰＳＭ胶束的微粒形态呈规则的球形，且粒径均一。??１４??

为研究ＯＤＡ取代度对ＰＳＭ胶束药物释放的影响，本研究以ｐＨ?７．４?ＰＢＳ为释??放介质，采用透析袋法对不同ＯＤＡ取代度ＰＳＭ胶束的体外释放行为进行表征（米??诺环素投药量为２０％）。结果如图１．５所示，结果表明：与游离ＭＣ．ＨＣ１相比，ＰＳＭ??的药物释放呈现明显的双相释放特征，前１２?ｈ释放相对较快，此后药物释放相对??缓慢，药物释放时间可延长至７２?ｈ。当固定米诺环素投药量为２０％时，随ＯＤＡ投??料比的增加，嫁接物中ＯＤＡ取代度增加，药物释放速率明显减慢，到７２?ｈ时，??ＰＳＯ（１０％）／ＭＣ和ＰＳＯ（２０％）／ＭＣ载药胶束的累积药物释放百分率分别为６１．５７?土??２．３７％和８５．４５?±?０．７８％，可能原因为随ＯＤＡ取代度的增加，疏水内核与米诺环??素间的相互作用力增强，从而使药物释放速率明显减慢，而米诺环素用于治疗ＳＣＩ??的主要机制为抑制急性原发性损伤后的继发性损伤，发挥其抗炎，抗氧化和神经保??护作用，较慢的药物释放速率不利于ＳＣＩ的治疗。基于此，我们选用ＯＤＡ投料比??为１０％得到的ＰＳＯ嫁接物进行后续研究。??１００－１??？?４０＼ｕｒ＾?—?ｍｃ．ｈｃｉ??＾?ｍ?一?ＰＳＯ（２０％）／ＭＣ??Ｉ?２０?Ｊ?一?ＰＳＯ（１０％）／ＭＣ??５?ｏｊ——

生成量和活细胞数目及细胞的活性呈正相关。甲瓒能够溶于二甲亚砜，并在５７０ｎｍ??处有紫外吸收，可采用酶标仪测定细胞经不同处理后在此波长下的吸光度值，从而??间接反映细胞的活性及增殖情况。结果如图２．１所示，当ＢＶ２细胞和原代小胶质??细胞与１？１００〇Ｈｇ／ｍＬ的嫁接物共孵育４８ｈ后，细胞的存活率均在９０％以上，说明??ＰＳＯ嫁接物具有低细胞毒性。??１２〇＞｜?ＥＳＳＳ３?ＢＶ２??ＣＳＳ?Ｐｒｉｍａｒｙ?ｍｉｃｒｏｇｌｉａ??ｉｌｌ??０?２?５?１０?２０?５０?１００?２００?５００?１０００??Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｍｇ／ｍＬ）??图２．１?ＢＶ２细胞和原代小胶质细胞与不同浓度的ＰＳＯ嫁接物共孵育４８?ｈ后的细胞??存活率??Ｆｉｇｒｕｅ?２．１?Ｃｅｌｌ?ｖｉａｂｉｌｉｔｉｅｓ?ｏｆ?ＢＶ２?ａｎｄ?ｐｒｉｍａｒｙ?ｍｉｃｒｏｇｌｉａ?ａｆｔｅｒ?ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ?ｗｉｔｈ?ＰＳＯ?ａｔ??ｖａｒｉｏｕｓ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ?ｆｏｒ?４８?ｈ．?Ｄａｔａ?ｗｅｒｅ?ｐｒｅｓｅｎｔｅｄ?ａｓ?ｍｅａｎ?土?ＳＤ?（ｎ?＝?５）??２．３．２多聚唾液酸－硬脂胺嫁接物胶束的细胞摄取??小胶质细胞作为中枢神经系统中的免疫细胞，广泛存在于大脑和脊髓中。脊髄??损伤后，小胶质细胞大量激活，广泛介导局部的炎症反应，并释放ＴＮＦ－ａ，１Ｌ－６等??细胞毒性物质，使损伤范围进一步扩大｜（＞５］。米诺环素用于治疗ＳＣＩ其中较重要的??作用机制为抑制小胶质细胞的激活，而作为药物递送系统，ＰＳＯ嫁接物能否将药??物递送至靶细胞内是评价此递送系统优劣的重要指标，因此本研究以原代小胶质??细胞和ＢＶ２细胞为模型细胞

本文编号：2893880