FADIINS抑制IL-1β激活的信号通路并抑制小鼠骨性关节炎进展的研究

发布时间：2020-11-22 06:39

　　研究背景骨性关节炎是一种常见的关节疾病,好发于60岁以上老年人。有文献指出,全球大约15%的人口都受到骨性关节炎的困扰。基于我国流行病学调查的结果显示,我国大约4%的人口都被诊断为骨性关节炎,在60岁以上的人口中,这一比例甚至高达42.8%。随着我国人口老龄化现状的加剧,可以预计,在未来的几十年,罹患骨性关节炎的人数会越来越高。但是针对骨性关节炎的治疗一直以来缺少有效的药物。在疾病发展早期,主要以关节疼痛为主要症状,所以一般采用止痛等对症治疗。随着疾病的进展,会逐渐出现活动障碍甚至致残,此时只有通过关节置换术才能进行治疗。这就意味着患者需要承担更多的痛苦,耗费更多的资金。一直以来,多国的专家学者进行了大量的实验,试图寻找到一种能够延缓甚至治愈骨性关节炎的药物。虽然耗费了大量的时间和资金,但是到目前为止,尚未找到一种能够实现上述目标的药物。如果研发一种新型的可以应用于临床的药物,往往需要大量资源,据统计,需要平均耗费几十亿美元和十几年时间。本课题组结合这一实际情况,试图从目前美国FDA(Food and Drug Administration)批准的已经在临床应用的药物库里,找到一种能够实现上述目标的药物。相比关节腔注射药物治疗来说,口服药物具有应用简单、携带方便、无创治疗等优点。所以,如果我们能够找到一种能够直接口服的药物,并且该药物具有缓解甚至治愈骨性关节炎的作用,这无疑减轻了患者在治疗时的痛苦,在生活中也提供了很多便利。骨性关节炎的病理特点是关节软骨的退变为主,滑膜和软骨下骨同时发生病变。长期以来,广大学者认为骨性关节炎是一种退行性病变。但是随着近年来对骨性关节炎发病机制的深入研究,逐渐发现骨性关节炎也是一种炎症性疾病。许多炎症因子在疾病的进展中发挥着重要作用,其中IL-1β已经被证实在骨性关节炎的发病过程中起到关键作用。正常的软骨细胞几乎不分泌IL-1β,但是关节软骨在遭受创伤时,软骨细胞分泌IL-1β水平明显升高。IL-Iβ可以与软骨细胞表面的IL-1受体结合,激活细胞内的一系列信号通路,从而激活下游的转录因子,使得金属蛋白酶的表达量增加,降解软骨外基质,引起关节软骨的病变,并最终引起骨性关节炎。研究目的1、应用包含beta-lactamase报告基因的THP-1细胞进行药物库筛选,找到一种可以抑制IL-1β激活的NF-κB通路的药物。2、将该药物应用于软骨细胞,验证该药物是否可以在软骨细胞上具有抑制IL-1 β激活的NF-KB通路的作用。3、用该药物治疗骨性关节炎模型的小鼠,检测是否具有预防小鼠骨性关节炎进展的作用。4、验证该药物抑制IL-1 β激活的NF-KB通路的作用机制。研究方法1、首先我们利用含有beta-lactamase报告基因的THP-1细胞进行药物库筛选,将细胞分为对照组,药物治疗组、IL-1β组,读取荧光数值后分别计算两组之间的比率,从而寻找能够抑制白介素-1 β作用的药物。2、将第一步初筛后得到的具有预期作用的药物升高药物作用浓度后,继续进行该试验。然后降低药物作用浓度后,继续进行该试验。3、根据各种药物的临床适应症排除那些用于治疗恶性肿瘤或者具有较大副作用的药物后,将剩余的药物进行最后一次筛选,选定一种作用效果最强的药物进行后续研究。4、将该药物作用于软骨细胞,western blot验证其NF-KB通路上的各个因子磷酸化是否被抑制。western blot和免疫荧光验证p65向细胞核的转移是否被抑制,Elisa验证NF-KB与DNA的结合能力是否被抑制。5、将该药物作用于软骨细胞,qRT-PCR和western blot验证其是否能够抑制金属蛋白酶的表达。应用qRT-PCR验证是否可以抑制其他炎症因子的表达。同时验证能否促进软骨外基质的合成。6、用该药物治疗骨性关节炎模型小鼠,分为药物治疗组和PBS治疗组,灌胃治疗16周,Safranin 0染色观察是否会延缓软骨丢失。应用免疫组化染色,判断该药物是否会延缓软骨外基质的降解,是否会抑制金属蛋白酶的表达。7、对骨性关节炎的小鼠进行行为学检测,观察是否会延缓小鼠行为能力的丧失。进行Von Frey痛阈检测,和疼痛相关的基因表达的检测,观察该药物是否会减轻骨性关节炎的症状。8、应用该药物处理软骨细胞,检测该药物是否对IL-1受体1(IL-R1)的表达有影响。9、应用该药物和自噬现象的抑制剂处理软骨细胞,检测该药物降解IL-R1是否与自噬现象有关。应用westernblot、免疫荧光和qRT-PCR检测该药物是否会激活自噬现象。实验结果1、用美国FDA批准的989种药物(1μmol/ml)和IL-lβ同时作用THP-1细胞,将得到OD460/OD530比值的结果做出点状图,显示有多种药物都具有抑制IL-1β激活的NF-KB信号通路。2、将初次筛选得到的54种药物作用浓度调整为10 μmol/ml,继续进行药物筛选,发现高浓度情况下,大部分药物仍然有抑制IL-1 β激活的NF-κB信号通路的作用。3、将初次筛选得到的54种药物作用浓度调整为0.1 μmol/ml,继续进行药物筛选,发现低浓度情况下,大部分药物的作用效果明显下降。4、根据FDA批准的药物适应症,排除那些用于治疗恶性肿瘤或者具有较大副作用的药物。按照最适药物浓度进行最后一次药物筛选,得到一种作用效果最强的药物,命名为 FADIINS(FDA-Approved Drugs that Inhibit IL-1β-NFκB Signaling),用于后续研究。5、将该药物作用于软骨细胞,发现其可以抑制NF-KB通路上的各个因子的磷酸化。6、该药物可以抑制p65向细胞核内转移,抑制NF-KB与DNA结合的能力。7、该药物可以抑制金属蛋白酶MMP-13和ADAMTS-4的表达,同时也可以抑制其他炎症因子的表达。8、FADIINS药物可以促进Aggrecan和胶原蛋白II的基因表达的上调。9、Safarnin 0染色显示该药物可以延缓细胞外基质的降解,应用OARSI Score评分标准,显示PBS治疗组关节炎严重于药物治疗组。检测关节炎模型小鼠的血清中COMP fragment浓度,显示药物治疗组的血清浓度低于PBS治疗组。10、组织切片进行免疫组化染色,显示药物治疗组的Aggrecan neo-epitope、COMP fragment、MMP13、Col X均少于PBS治疗组,而Col Ⅱ则多于PBS治疗组。人软骨组织离体培养后,检测培养基中GAG浓度,显示经药物治疗后,GAG的浓度明显下降。11、在骨性关节炎模型(DMM模型)治疗到10周时,开始测试小鼠的5分钟行走距离,每周一次直至实验结束,结果显示药物治疗组的行走距离明显多于PBS治疗组。统计小鼠5分钟站立的次数,显示药物治疗组多于PBS治疗组12、进行Von Frey痛阈测试,显示药物治疗组小鼠患肢的疼痛耐受力要高于PBS治疗组。收集小鼠的背根神经节,提取RNA后,反转录并进行实时定量PCR检测,显示MCP-1和CCR的基因表达水平在药物治疗组低于PBS治疗组。13、软骨细胞被药物处理后,提取细胞蛋白,行western blot检测细胞膜的IL-1受体1(IL-R1)的水平,显示用药物处理后,IL-R1水平有所下降。免疫荧光实验显示药物处理后的细胞膜表面的IL-R1荧光量少于未治疗组。免疫组化结果也显示,药物治疗组软骨细胞表面的IL-R1少于PBS治疗组。14、软骨细胞被Rapamycin处理后,提取细胞蛋白行western blot检测示IL-R1的水平下降,同时应用Rapamycin和Baflomycin处理后,IL-R1的水平恢复,用FADIINS药物处理后IL-R1的水平下降,同时应用FADIINS药物和Baflomycin处理后,IL-R1的水平恢复。15、软骨细胞应用FADIINS药物处理后,实验结果显示LC3II、游离的ATG12水平高于对照组,ATG5-ATG12水平也高于对照组。PCR结果显示自噬现象的MarKer,如LC3、ATG5、ATG12的基因水平均升高。软骨细胞被FADIINS药物处理后,免疫荧光结果显示LC3表达量明显上升。结论1、利用含有beta-lactamase报告基因的THP-1细胞进行药物库筛选,得到一种能够抑制IL-1β作用的药物。2、该药物可以在软骨细胞上抑制IL-1 β激活的NF-KB通路,可以抑制MAPK和NF-KB通路上的蛋白磷酸化。该药物可以抑制p65向细胞核内转移,也可以抑制NF-KB与DNA的结合。3、该药物可以在软骨细胞抑制金属蛋白酶MMP-13和ADAMTS-4的合成,同时抑制一些炎症因子的合成。4、该药物在一定程度上具有促进软骨外基质修复的作用。5、应用该药物治疗骨性关节炎模型小鼠后,可以有效地缓解软骨细胞外基质的降解。并且也抑制金属蛋白酶的合成。6、该药物可以改善骨性关节炎的症状,延长步行距离,增加站立次数,同时减轻患肢疼痛。7、该药物可以激活自噬现象,并且在软骨细胞上可以通过自噬现象,降解IL-R1。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R684.3
【文章目录】：
中文摘要
英文摘要
主要英文缩略词表
第一部分: 药物库筛选得到抑制IL-1 β激活的信号通路的药物
    前言
    实验材料及方法
    实验结果
    讨论
    结论
    参考文献
第二部分: FADIINS抑制IL-1β激活的信号通路且抑制软骨细胞的分解代谢
    前言
    实验材料及方法
    实验结果
    讨论
    结论
    参考文献
第三部分: FADIINS药物可以抑制小鼠骨性关节炎的进展
    前言
    实验材料及方法
    实验结果
    讨论
    结论
    参考文献
第四部分: FADIINS通过自噬降解IL-R1
    前言
    实验材料及方法
    实验结果
    讨论
    结论
    参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文及参编书目
学位论文评阅及答辩情况表
英文文章一
英文文章二

【参考文献】

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4 吕苏梅;张瑞丽;;中老年膝骨关节炎的流行病学研究进展[J];中国老年学杂志;2016年16期

5 陈威;李盛华;周明旺;陈娴;叶丙霖;郭铁峰;孙凤歧;;膝骨性关节炎软骨自噬机制研究进展[J];中国矫形外科杂志;2016年13期

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7 李广恒;戴尅戎;;膝关节骨性关节炎分子发病机制和治疗展望[J];郑州大学学报(医学版);2015年02期

8 马东华;刘敏;黄庭山;石坚;张朝跃;;湖南省桑植县膝关节骨性关节炎发病原因的流行病学调查[J];医学临床研究;2014年04期

9 刘华;李化光;;膝关节骨关节炎流行病学研究进展[J];中国矫形外科杂志;2013年05期

10 陆艳红;石晓兵;;膝骨关节炎国内外流行病学研究现状及进展[J];中国中医骨伤科杂志;2012年06期

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