HRM技术在成骨不全COL1A1/COL1A2基因突变筛查中的应用

发布时间：2020-12-27 09:13

　　目的:建立并探讨聚合酶链式反应-高分辨率熔解曲线（polymerase chain reaction and high resolution melting,PCR-HRM）分析技术筛查中国汉族人群成骨不全（osteogenesis imperfecta,OI）患者COL1A1/COL1A2基因突变的方法。应用PCR-HRM技术筛查OI患者COL1A1/COL1A2基因突变位点,利用Sanger测序验证,并分析临床表现型与基因型的关联。方法:1.研究PCR-HRM技术的最佳反应条件,模板（DNA）浓度、PCR-HRM引物设计及引物浓度、退火温度（annealing temperature,AT）、循环数等。2.应用PCR-HRM技术结合Sanger测序对87例患者及对照者进行COL1A1/COL1A2基因筛查,有家族史的患者,也要同时进行家属的基因测序验证。对筛查结果阳性的患者进一步分析其临床表型及基因型的联系。3.在未用PCR-HRM技术筛查出异常的患者中,随机选取其中3例进行全基因组测序（whole-genome sequencing,WGS）分析,以确定未检测出异常的原因。结果:... 

【文章来源】：天津医科大学天津市 211工程院校

【文章页数】：91 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

先证者影像资料图

.3.2 家系 Sanger 测序结果先证者及其父母的 Sanger 测序结果显示，先证者 COL1A1 基因第 45 号外子区域发生两处杂合突变，分别为 c.3235G>A 和 c.3247G>A，分别来自其父，见图 8。其中，c.3247G>A 经核查证实为单核苷酸多态性（single nucleotideolymorphism，SNP）位点（rs372029024），但尚无人群发生率的统计数据，其病性也尚未确定；c.3235G>A 在数据库中已有过 17 次报道且为致病突变。先者 COL1A1 基因第 45 号外显子同时存在两个突变位点的情况与其他患者的个点突变不同，为首次发生，该结果已提交至人类胶原突变数据库，编号为OL1A1_00204，COL1A1_00891。图 7 家系 PCR-HRM 筛查结果①：标准熔解曲线；②：差异熔解曲线。曲线 1 为先证者，曲线 2 为先证者父母，曲线 3 为正常组

2.3.3 突变预测软件概述选取三种生物信息学软件：PolyPhen2，SIFT 和 Align GVGD 预测 COL1A基因突变引起的氨基酸变化对蛋白功能的影响。Polyphen2 在线网站：http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/，SIFT 在线网站：http://sift.jcvi.org/，Align GVGD 在线网站：http://agvgd.hci.utah.edu/。这三个软件为在线应用的软件，在预测错义突变以及 SNP 而导致的蛋白质功能异常方面应用广泛，其他形式如无义突变（突变导致提前形成终止密码）、碱基插入或缺失所造成的框移突变以及起始密码子的突变均不可以预测。因此，以上的使用条件恰好符合我们对于患儿两处点突变的效应进行评估，当其中至少两种软件预测结果一致时，可信度更大。图 8 家系 COL1A1 基因第 45 号外显子测序结果①：先证者（c.3235G>A、c.3247G>A）；②：先证者父亲（c.3235G>A）；③：先证者母亲（c.3247G>A）；④：对照


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