外泌体内CTHRC1促进创面愈合与TBC1D3调控的机制研究

发布时间：2021-01-12 04:16

　　研究背景:急性创面愈合是外科工作中常见而重要的过程,创面愈合受多种局部因素或全身条件的共同影响,然而在目前的临床实践中,急性创面的愈合却缺乏安全有效的治疗方法。外泌体在细胞间信号传递、细胞调控方面发挥着重要作用,外泌体中存在一类外泌蛋白CTHRC1,有报道称此类蛋白可以促进各类组织的愈合。TBC1D3是一种人类特异性基因,可以调控外泌体的释放。研究目的:研究外泌体及其中的CTHRC1蛋白对急性创面愈合的影响及其机制,探索TBC1D3对外泌体的调控作用并分析其分子机制。研究方法:我们首先应用聚乙烯醇海绵内植物（PVA）小鼠模型以模拟创面修复内环境并将其作为创面外泌体的来源,对外泌体进行收集和分析;体外试验验证外泌体与CTHRC1蛋白的功能和安全性;应用小鼠创面模型分别对外泌体和CTHRC1促进愈合作用进行评估,并应用蛋白组学分析、流式细胞技术、Western Blot和PCR等技术对PVA中细胞、细胞因子及外泌体进行分析,之后应用GSI小鼠以探索CTHRC1的作用机制;最后应用慢病毒转染和获得性转移技术,明确TBC1D3在体内外对外泌体释放的调控作用和作用机制。研究结果:小鼠PVA模型可... 

【文章来源】：上海交通大学上海市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：92 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

PVA内植物中收集的外泌体蛋白质谱、NTA和VFC分析。(A)PVA海绵内植?物模型建模,其中从浸润的分泌液中分离EV;(B)使用抗四跨膜蛋白CD9,CD63和CD81的抗体,在7天后对PVA海绵植?物中释放的EV进?囊泡流式细胞术(VFC)分析,结果分别定义了可洗脱可溶性的囊泡(图1B,浅灰?)与不溶性囊泡(图1B,深灰?);(C)在植?PVA后第7天收集的EV上对整合素亚基和MHC II进?的VFC分析,以评估EV上存在的整合素的概况。可见在第1 天和第7天EV之间没有观察到整联蛋白的显着差异;(D)植?后第7天收集的EV(红?实线)的NTA结果显示平均直径134.9+/-31.5nm,与第1 天EV(??实线)平均直径125+/-23.8nm没有显着差异;(E、F)植?后第1 天和第7天提取的EV的蛋白质组学分析,蛋白质?平的变化均以?第1天?平进?标准化,并如材料和?法中所述进?定量,可见与信号传导和膜动?学相关的蛋白质的变化。我们将与第1天相比,第7天EV中表达增加幅度最?的前10种蛋白质(E)与减少幅度最?的10种蛋白质的(F)列表进?展示。

为了明确创面外泌体负载的生物学功能,我们将从植入供体小鼠第7天后的PVA植入物(即供体小鼠PVA)中获取的外泌体(供体EV),注射入到受体小鼠体内预先植入的新鲜PVA植入物中(如图2A所示),并使用脂质体作为对照以排除脂质的白细胞募集效应[127]。如图2B-E所示,第7天供体海绵EV的转移(红色曲线)导致表达巨噬细胞标记物F4/80和整合素CD11b,CD11c和CD49b阳性的创面床单核细胞/巨噬细胞数量的显著增加。这些观察结果证实,源自创面的EV可加速单核细胞/巨噬细胞的募集。2.3.5 创面外泌体在小鼠创面愈合体内实验中促进愈合

外泌体可以被创面细胞内化并促进创面愈合进程。(A)我们将从植?供体小鼠第7 天后的PVA植?物(即供体小鼠PVA)中获取的外泌体(供体EV),应用到预先建立的受体小鼠创面愈合模型中。(B)将用荧光PKH26标记的供体EV获得性转移?受体小鼠新鲜创面部位,孵育18小时,通过共聚焦显微镜成像,与对照组对照比较。图片显示EV被创面细胞摄取后在细胞内聚集。比例尺=60μm。(C)受体小鼠的创面愈合曲线,在加?收集的PVA供体来源的EV(红?)与PBS(蓝?)后,隔日记录创面面积,得出各组小鼠的创面愈合情况。(外泌体组和对照组组之间:**,P<0.01;***,P<0.001,每组n=6)。


本文编号：2972130