应用CRISPR/Cas9系统在G401细胞株中敲除p21基因

发布时间：2021-01-21 15:34

　　目的运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,在人恶性横纹肌样瘤细胞株G401中敲除p21基因。方法通过反转录定量PCR（RT-q PCR）及Western blot检测各瘤细胞株中p21的表达,针对p21基因作用的功能域,设计了靶向人p21基因第3个外显子的向导RNA（sg RNA）,克隆入lenti CRISPR v2载体。将测序及酶切鉴定正确的重组质粒在293T工具细胞中制备慢病毒颗粒并感染G401细胞,使用嘌呤霉素进行阳性细胞筛选,显微镜下挑取单克隆细胞团并继续培养获得G401单克隆细胞株。提取单克隆细胞株RNA及蛋白,利用RT-q PCR及Western blot方法检测细胞株中p21的敲除效果。结果 p21在人横纹肌样瘤细胞中高表达。成功构建靶向p21基因的lenti CRISPRv2-sg RNA重组慢病毒质粒。与对照组相比,筛选得到的G401亚克隆细胞系中p21蛋白表达缺失。结论针对难转染的G401细胞,应用CRISPR/Cas9系统成功构建了p21基因敲除的稳定株,为后续深入研究p21在人恶性横纹肌样瘤中的作用机制奠定了基础。 

【文章来源】：天津医药. 2016,44(10)

【文章页数】：5 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1实验材料
        1.1.1质粒、菌株及细胞
        1.1.2酶类及主要试剂
        1.1.3其他
    1.2方法
        1.2.1 sg RNA oligo序列的设计
        1.2.2 lenti CRISPR v2-p21的构建与鉴定
        1.2.3病毒包装、细胞感染及单克隆细胞的获得
        1.2.4 Western blot及反转录定量PCR（RT-q PCR）检测p21的表达
    1.3统计学方法
2 结果
    2.1 p21在人MRT细胞中的表达
    2.2 sg RNA靶点的选择及寡核苷酸序列
    2.3 重组质粒lenti CRISPR v2-p21的测序及酶切
    2.4 Western blot及RT-q PCR检测p21基因敲除的效果
3 讨论
    3.1 p21在肿瘤中的双重作用
    3.2 CRISPR/Cas9慢病毒系统


【参考文献】：
期刊论文
[1]Oncogenic role of p21 in hepatocarcinogenesis suggests a new treatment strategy[J]. Shogo Ohkoshi,Masahiko Yano,Yasunobu Matsuda.  World Journal of Gastroenterology. 2015(42)
[2]利用CRISPR/Cas9n系统构建Asxl2基因敲除的NIH3T3稳定细胞系[J]. 方佳萍,赵秀娟,齐艳,王玺,吴旭东,娄建石.  天津医药. 2015(10)



本文编号：2991423