MiR-27b通过PPAR-γ抑制软骨细胞肥大化作用的研究

发布时间：2017-04-12 06:11

  本文关键词：MiR-27b通过PPAR-γ抑制软骨细胞肥大化作用的研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：脊椎动物骨骼的生长发育主要是靠膜内骨化和软骨内骨化完成的。其中,软骨内骨化主要发生在四肢骨和躯干骨等大部分骨骼元件中,是骨的发育和生长阶段中一个关键的生理过程。该过程起始于间充质干细胞的凝集并分化形成软骨细胞,随后,软骨细胞经过增殖、成熟、肥大化的分化步骤分化为肥大化的软骨细胞,再经历细胞凋亡、钙化、血管入侵,破骨细胞和造骨细胞产生等一系列过程,最终以退化的软骨基质为构架产生骨基质。在某种情况下,软骨细胞肥大化进程发生异常,将发生由软骨降解和结构破坏、软骨发育异常等原因引起的相关疾病,如,骨关节炎以及软骨发育不全等。因此,深入研究软骨细胞肥大化分子机制,对于软骨细胞肥大化相关疾病的预防和治疗具有重要意义。随着micro RNAs(mi RNAs)在脊椎动物软骨发育中的作用被发现和报道,在软骨分化过程中的相关mi RNAs功能研究成为了骨关节炎与骨骼发育病理研究的一大热点。本文旨在探究micro RNA-27b(mi R-27b)在软骨细胞肥大化过程中的作用,并分析其通过靶基因之一过氧化物酶增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)在软骨细胞肥大化过程中的调控机制。本研究以出生1-3天的大鼠乳鼠膝关节软骨为研究对象,用免疫组化、RT-PCR的方法观察正常软骨细胞标志物II型胶原(COL II)以及肥大化标志物X型胶原(COL X)、MMP-13的表达情况以确定膝关节软骨的静止区、增殖区和肥大化区,用原位杂交实验以及RT-q PCR检测mi R-27b的分布情况。结合生物信息学网站、双荧光素酶报告基因实验系统以及Western blot确定PPAR-γ为其靶基因之一。并在此基础上进行mi R-27b过表达实验,分为实验组(mi R-27b mimic)、阴性对照组(negative control)、和转染试剂对照组(normal),分别从基因和蛋白水平证实mi R-27b对软骨细胞肥大化的抑制作用。结果:1.形态学染色结果显示,软骨细胞柱状排列,由关节表层至深层,体积逐渐增大,COL X表达增加。2.原位杂交结果显示,mi R-27b主要表达在细胞核中,随着软骨细胞肥大化分化,其表达量逐渐下降。RT-q PCR结果显示,与肥大化期软骨细胞相比,静止期软骨细胞mi R-27b的表达高至6.2倍(P0.01)。3.通过生物信息学网站分析,确认PPAR-γ3’-UTR序列上存在mi R-27b的结合位点;双荧光素酶报告基因实验证实,在软骨细胞中rno-mir-27b-3p对psi CHECK-PPAR-γ(p0.01)的荧光表达有显著抑制作用。Western blot结果显示,mi R-27b mimic转染组,PPAR-γ2表达明显下调。4.分离培养肥大化软骨细胞,并对其进行过表达干预,同时用软骨细胞肥大化诱导液继续肥大化诱导。7天后,实验组与对照组均有油红O染色阳性的脂滴出现,实验组与转染试剂对照组和阴性对照组相比,脂滴数量明显降低(P0.01)。5.RT-q PCR结果显示,mi R-27b过表达以后,COL II、SOX-9表达增加(P0.01),MMP-13、PPAR-γ表达下降(P0.01);Western blot结果显示,mi R-27b过表达以后,PPAR-γ2与COL X的蛋白表达明显受到抑制。结论:1.Mi R-27b对软骨细胞肥大化发挥负调控作用。2.提高mi R-27b的表达可以推迟软骨细胞肥大化进程。3.PPAR-γ是mi R-27b的靶基因之一,它可能通过某种机制正调控COL X的表达。
【关键词】：软骨细胞 肥大化 MiR-27b PPAR-γ
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R68
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 第1章 绪论11-17
• 1.1 软骨内骨化11-13
• 1.1.1 软骨内骨化过程简介11-12
• 1.1.2 软骨细胞肥大化过程的调控12-13
• 1.1.3 软骨细胞肥大化异常引发的相关疾病13
• 1.2 MicroRNAs与软骨发育13-16
• 1.2.1 MicroRNAs简介13-14
• 1.2.2 MiRNAs与软骨发育调控14-15
• 1.2.3 MiR-27b与软骨分化15-16
• 1.3 PPAR-γ 与软骨分化16-17
• 第2章 材料与方法17-31
• 2.1 实验材料17-20
• 2.1.1 实验仪器和设备17-18
• 2.1.2 实验试剂18-19
• 2.1.3 主要试剂的配制19-20
• 2.1.4 实验动物20
• 2.2 实验方法20-31
• 2.2.1 大鼠膝关节软骨组织学染色20-21
• 2.2.2 原位杂交21-22
• 2.2.3 软骨细胞分离培养22
• 2.2.4 RT-PCR及RT-qPCR22-27
• 2.2.5 双荧光素酶报告基因实验27-29
• 2.2.6 细胞转染29
• 2.2.7 Western blot29-30
• 2.2.8 统计学分析30-31
• 第3章 实验结果31-38
• 3.1 大乳鼠膝关节软骨相关基因及miR-27b表达情况31-33
• 3.1.1 大乳鼠膝关节软骨形态学特点31
• 3.1.2 大乳鼠膝关节软骨组织相关基因表达情况31-32
• 3.1.3 大乳鼠膝关节软骨组织miR-27b表达及分布情况32-33
• 3.2 MiR-27b靶点预测33-34
• 3.2.1 MiR-27b靶点生物信息学预测33
• 3.2.2 双荧光素酶报告基因实验33-34
• 3.3 Mi R-27b过表达干预实验34-38
• 3.3.1 Mimics最佳转染浓度筛选34-35
• 3.3.2 上调miR-27b后软骨细胞转分化现象35-36
• 3.3.3 上调miR-27b对肥大化软骨细胞相关基因表达的影响36-37
• 3.3.4 上调miR-27b对肥大化软骨细胞相关蛋白表达的影响37-38
• 第4章 讨论38-43
• 第5章 结论43-44
• 参考文献44-50
• 作者简介和科研成果50-51
• 致谢51

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