人脐带间充质干细胞来源外泌体对退变椎间盘髓核干/祖细胞的作用

发布时间：2021-02-02 02:32

　　目的:外泌体（exosomes）是近几年干细胞研究的新突破之一。越来越多的证据表明干细胞植入治疗起主要修复作用的不是干细胞本身,而是其分泌的各种活性物质,exosomes是这些物质中起主导作用的成分。本文主要研究脐带间充质干细胞（umbilical cord-derived mesenchymal stem cells,UC-MSCs）来源的exosomes对退变椎间盘髓核干/祖细胞（degenerative intervertebral disc nucleus pulposus stem/progenitor cells,D-NPMSCs）的作用。主要从细胞的增殖能力、多能性和炎症细胞因子等方面评估exosomes的作用,并探讨其作用机制。方法:采用酶消化法和组织块法分别从退变髓核组织和健康新生儿脐带组织中提取D-NPMSCs和UC-MSCs,并扩增培养。使用超高速离心法从收集的UC-MSCs条件培养液提取exosomes,并使用透射电镜,纳米粒子分析系统和免疫印迹的方法对提取的exosomes进行鉴定。将得到的exosomes作用于D-NPMSCs后,流式细胞术检测其MSC特异表... 

【文章来源】：暨南大学广东省 211工程院校

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【学位级别】：硕士

【部分图文】：

UC-MSCs来源exosomes纳米粒子系统分析浓度图

暨南大学硕士学位论文254.2exosomes的摄取本实验采用Dil染色液对exosomes染色后，与细胞共培养8小时，在荧光显微镜下观察exosomes是否在细胞内。结果显示，在D-NPMSCs细胞内观察到明显的红色荧光（图2），这说明UC-MSCs来源的exosomes和细胞培养可以被D-NPMSCs摄龋图2将D-NPMSCs与Dil标记的exosome一起孵育8小时，并用荧光显微镜观察。红色，Dil荧光；蓝色，DAPI染色的细胞核。Exosome被D-NPMSCs摄取（标尺：50μm）。4.3exosomes最适作用剂量分析exosomes对D-NPMSCs增殖的最适作用剂量通过CCK8来确定。把exosomes的浓度梯度设计成0、5、10、20、40、60、80ug/ml，作用72小时后，检测CCK8的OD值（图3）。如图所示，与0μg/ml组相比，exosomes作用后的OD值明显提高，且呈上升趋势，表明D-NPMSCs对exosomes具有剂量依赖性·。当exosomes浓度在80μg/ml时，OD值为最大，但与浓度为40μg/ml的值相差不大。根据实验最优方案，所以本实验选择40μg/ml的浓度为最佳浓度，往后各实验均用这一浓度。从该实验可以看出exosomes对D-NPMSCs具有促进细胞活性的作用，且随浓度的升高，细胞活性增强。

暨南大学硕士学位论文26图3CCK8检测不同浓度exosomes与D-NPMSCs培养72小时后的细胞活力。数据呈现为平均值±SD，n=3（p<0.01）。4.4exosomes对D-NPMSCs的MSC表面标志物的表达影响本实验前期研究发现，D-NPMSCs的MSC表面标志物CD105和CD29比健康的NPMSCs的表达明显降低，导致了D-NPMSCs再生能力的减弱，因此本实验研究外泌体对D-NPMSCs的MSC表面标志物表达的影响。将D-NPMSCs用exosomes处理72小时后，通过流式细胞术检测MSC表面标志物的细胞表达情况。由实验结果得，MSC-Exo和对照组相比，CD44和CD73的细胞表达率没有明显变化，且细胞表达率大于95%，符合MSC鉴定标准。然而，对照组的CD105和CD29的细胞表达率则低于95%，但MSC-Exo显著提高CD105和CD29的细胞表达率（图4）。由此可见，exosomes可以提高D-NPMSCs的MSC表面标志基因的细胞表达率。


本文编号：3013882