SIRTl对氧化应激诱导大鼠衰老髓核细胞的调控作用及机制研究
发布时间：2021-02-04 21:10
目的:本研究旨在探索SIRT1对氧化应激诱导的大鼠髓核细胞衰老发生的影响,探明Akt-FoxO1轴在氧化应激诱导衰老的过程中调控SIRT1的机制,为进一步椎间盘退变靶向治疗药物的筛选和临床治疗提供理论依据。方法:（1）应用HE染色、甲苯胺蓝染色和Ⅱ型胶原蛋白免疫荧光染色鉴定原代大鼠髓核细胞;（2）应用ROS检测、CCK-8试验、Hoechst染色和流式细胞检测凋亡确定亚致死性的H2O2浓度,建立大鼠衰老髓核细胞模型;（3）利用定量PCR和Western blot及免疫荧光分析氧化应激对SIRT1表达的影响;（4）利用特异性药物激活SIRT1,探明其在氧化应激诱导衰老过程中的调节机制;（5）利用Western blot、免疫荧光及特异性药物探明Akt-FoxO1-SIRT1轴在氧化应激诱导衰老过程中的影响及调节机制;（6）利用定量PCR、Western blot及免疫荧光技术探明白藜通过芦醇对氧化应激诱导的大鼠衰老髓核细胞的影响。结果:（1）通过三种与髓核细胞相关的相对特异性染色明确所培养的原代细胞为大鼠髓核细胞;（2）H2O2是以ROS的形式作用于大鼠NP细胞,其亚致死性浓度为50-1...
【文章来源】：苏州大学江苏省
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．大鼠原代髓核细胞的染色鉴定（比例尺＝５０ｐｍ）??
第二章实验结果?ＳＩＲＴ１对氧化应激诱导大鼠髓核细胞衰老的调控作用及机制研宄??建立的体外大鼠ＮＰ细胞衰老模型中，发现随着活性氧的聚集，ＦｏｘＯｌ的表达逐渐下??降（图６Ａ）。而ＦｏｘＯｌ的活性由转录后修饰如磷酸化、乙酰化和泛素化等形式参与??调节，这些修饰影响了?ＦｏｘＯｌ的亚细胞定位、作为转录调节器的活性和稳定性［１９，??３７］。随后，我们还发现在这个过程中ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ途径被激活，激活的磷酸化Ａｋｔ（?Ｓｅｒ４７３）??通过翻译后修饰促进了?ＦｏｘＯｌ在Ｓｅｒ２５６位点上的磷酸化（图６Ａ，Ｂ）。先前有研宄??表明磷酸化的ＦｏｘＯｌ在细胞质中定位并失活［１９，?２０］，因此，我们用免疫荧光法验证??ＦｏｘＯｌ是否在氧化应激的作用下在大鼠ＮＰ细胞中发生了核质穿梭，从结果中我们发??现Ｈ２〇２处理组大鼠ＮＰ细胞核中ＦｏｘＯｌ荧光显著弱于对照组，这提示氧化应激确实??明显抑制了?ＦｏｘＯｌ在大鼠ＮＰ细胞中的核定位（图５Ｃ）。??图６??Ａ?Ｂ????Ｈ；０：?Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｎＭ）??ｐ－Ａｋｔ（Ｓ４７３）?ｍｍｍ?ＭＷ?６０?＾＾０??—?－?－ｊ?■乃??—＾—－、二－—?＿ｉ５（）??Ｐ－Ｆｏｘ０１（Ｓ２５叫一Ｘ?＿?＿?＿?■ｙｕｐ?｜?？?Ｉ??ＦｏｘＯｌ?一一?８２?｜?｜２－?…??＿，ｎ丨麵＿？?＿蠢叫４５?ｉ＇－｜Ｔ?９｜Ｔｊｎｍ￣??Ｈ２〇２?ｐ－Ａｋｔ?（Ｓ４７３）?Ａｋｔ?ｐ－ＦｏｘＯｌ?（Ｓ２５６）?ＦｏｘＯｌ??ＤＡＰＩ?ＦｏｘＯｌ?Ｍｅｒｇｅ??■■■??图６．Ｈ２Ｏ２激活ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路使ＦｏｘＯｌ发生磷酸化（比例尺＝
ＳＩＲＴ１对氧化应激诱导大鼠髓核细胞衰老的调控作用及机制研宄?第二章实验结果??ＮＰ细胞。首先，ＭＫ－２２０６抑制了?ｐ－Ａｋｔ的表达，这使得ＦｏｘＯｌ在Ｓｅｒ２５６位点的磷??酸化下降，并进一步导致ＦｏｘＯｌ总蛋白的表达增加（图７Ａ，Ｂ）。此外，ＡＳ１８４２８５６??作为ＦｏｘＯｌ的抑制剂，仅通过与ＦｏｘＯｌ结合而降低其活性，而不影响其转录［２５］。??在本实验中，经ＡＳ１８４２８５６处理后，ｐ－ＦｏｘＯｌ和ＦｏｘＯｌ蛋白表达与对照组比较无显??著性差异，但与对照组相比，ｐ－Ａｋｔ的表达降低（图７Ａ，?Ｂ）。最后，在ＳＩＲＴ１蛋白??表达水平上，单纯ＭＫ－２２０６处理抑制ｐ－Ａｋｔ活性后促进了?ＳＩＲＴ１的表达，但若ｐ－Ａｋｔ??的表达被抑制的同时用ＡＳ１８４２８５６抑制ＦｏｘＯｌ活性，ＳＩＲＴ１的表达是被抑制，并没??有如单纯ＭＫ－２２０６处理组一样表达增加（图７Ａ，Ｂ）。??图７??Ａ?ＲａｉＮＰ?ｃｅｌｌｓ?Ｂ??ＡＳ?１８４２８５６?＋?－?＋?§■?Ｃｏｎｔｒｏｌ??ＡＳ?１８４２８５６??ＭＫ－２２０６?－?＋?＋?２?Ｏｎ?Ｂｉ?ＭＫ－２２０６??＿???＊＂?■■?ＡＳＩ８４２８Ｓ６－ＭＫ－２２０６??ｐ－Ａｋｌ（Ｓ４７３）?？?６０?Ｓ?ｇｍ??他丨】ｉ１５．?Ｔ?■?ｉ??ｐ－￣ｆ?ｌｆ＇°ｌｖ?１１｜Ｔ?Ｉ?：｜ｖｋ??Ｆ〇ｘＱ１?二?＊＂＊卜?＾ａＳＪ?Ｉ?ＩＩＩ?Ｉ?Ｉ?Ｉ?ＩＩ??｜＾－ａｃｔｉｎ?１４５?ｐ－Ａｋｔ?（Ｓ４７３）?Ａｋｔ?ｐ－ＦｏｘＯｌ?（Ｓ２５６）?ＦｏｘＯｌ?ＳＩＲＴ１??图７．Ａｋｔ、ＦｏｘＯｌ和ＳＩＲＴｌ之间存在级
本文编号：3018942
【文章来源】：苏州大学江苏省
【文章页数】：52 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１．大鼠原代髓核细胞的染色鉴定（比例尺＝５０ｐｍ）??
第二章实验结果?ＳＩＲＴ１对氧化应激诱导大鼠髓核细胞衰老的调控作用及机制研宄??建立的体外大鼠ＮＰ细胞衰老模型中，发现随着活性氧的聚集，ＦｏｘＯｌ的表达逐渐下??降（图６Ａ）。而ＦｏｘＯｌ的活性由转录后修饰如磷酸化、乙酰化和泛素化等形式参与??调节，这些修饰影响了?ＦｏｘＯｌ的亚细胞定位、作为转录调节器的活性和稳定性［１９，??３７］。随后，我们还发现在这个过程中ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ途径被激活，激活的磷酸化Ａｋｔ（?Ｓｅｒ４７３）??通过翻译后修饰促进了?ＦｏｘＯｌ在Ｓｅｒ２５６位点上的磷酸化（图６Ａ，Ｂ）。先前有研宄??表明磷酸化的ＦｏｘＯｌ在细胞质中定位并失活［１９，?２０］，因此，我们用免疫荧光法验证??ＦｏｘＯｌ是否在氧化应激的作用下在大鼠ＮＰ细胞中发生了核质穿梭，从结果中我们发??现Ｈ２〇２处理组大鼠ＮＰ细胞核中ＦｏｘＯｌ荧光显著弱于对照组，这提示氧化应激确实??明显抑制了?ＦｏｘＯｌ在大鼠ＮＰ细胞中的核定位（图５Ｃ）。??图６??Ａ?Ｂ????Ｈ；０：?Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?（ｎＭ）??ｐ－Ａｋｔ（Ｓ４７３）?ｍｍｍ?ＭＷ?６０?＾＾０??—?－?－ｊ?■乃??—＾—－、二－—?＿ｉ５（）??Ｐ－Ｆｏｘ０１（Ｓ２５叫一Ｘ?＿?＿?＿?■ｙｕｐ?｜?？?Ｉ??ＦｏｘＯｌ?一一?８２?｜?｜２－?…??＿，ｎ丨麵＿？?＿蠢叫４５?ｉ＇－｜Ｔ?９｜Ｔｊｎｍ￣??Ｈ２〇２?ｐ－Ａｋｔ?（Ｓ４７３）?Ａｋｔ?ｐ－ＦｏｘＯｌ?（Ｓ２５６）?ＦｏｘＯｌ??ＤＡＰＩ?ＦｏｘＯｌ?Ｍｅｒｇｅ??■■■??图６．Ｈ２Ｏ２激活ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ通路使ＦｏｘＯｌ发生磷酸化（比例尺＝
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