过表达microRNA-126骨髓间充质干细胞移植治疗脊髓损伤的血管重构和炎症反应
发布时间：2021-02-10 18:40
【目的】:观察脊髓损伤（SCI）大鼠脊髓内移植过表达microRNA-126骨髓间充质干细胞（BMSC）后的血管重构和炎症反应情况,初步评估过表达microRNA-126BMSC移植对脊髓损伤治疗神经功能的促进作用。【方法】:1.全骨髓贴壁法培养骨髓间充质干细胞（BMSC）,并鉴定。构建并鉴定过表达miR-126慢病毒载体系统,经293T细胞包装,筛选稳定过表达miR-126的慢病毒并转染BMSC。2.SD大鼠脊髓损伤打击模型的建立及实验分组。将108只大鼠随机分为单纯脊髓损伤组（对照组,36只）、脊髓损伤空白载体BMSC移植组（实验Ⅰ组,36只）,脊髓损伤过表达miR-126BMSC移植组（实验Ⅱ组,36只）。3.各组大鼠分别于脊髓损伤术后3天、7天、28天灌注取材,HE染色观察损伤脊髓形态及损伤空洞大小,尼氏体染色观察尼氏体再生情况。4.各组大鼠分别于脊髓损伤术后1天、3天、7天灌注取材行大鼠内皮细胞特异性抗体（RECA-1）和小胶质细胞标记物（CD68）的双重免疫荧光染色。于脊髓损伤术后1周、4周灌注取材行神经轴突（N52）和星形胶质细胞（GFAP）的双重免疫荧光染色。定量分析各...
【文章来源】：福建医科大学福建省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
A:NYUImpactor-Ⅲ打击器,B:大鼠脊髓打击造模，C:大鼠造模前暴露T10段脊髓，D:打击后脊髓充血
19使用SPSS25.0进行数据分析。所有测量结果表示为平均值±标准偏差。当样本方差不等时，将Welch检验用作方差的替代分析。使用Dunnett-T检验进行单向方差分析和LSD-t检验评价组间差异。显著性定义为p<0.05的水平。结果1.实验动物情况选取的108只SD大鼠，实验过程中死亡8只，1只死于术中出血过多，5只死于麻醉过量，另外2只死于膀胱破裂，重新补充后纳入数据分析。2.分离培养鉴定骨髓间充质干细胞（BMSC）并通过慢病毒转染系统构建稳定表达过表达microRNA-126BMSC。前期已经成功完成BMSC的分离培养及鉴定，并成功构建慢病毒转染系统并已筛选出稳定表达细胞株。3.HE染色HE染色可发现对照组脊髓打击损伤后3天，受损伤处脊髓中央灰质可见大片出血、尼氏体消失、髓鞘断裂、细胞空泡样变性、部分细胞细胞核固缩、大量炎性细胞浸润，损伤周围组织出现囊腔样变化。损伤后7天（如图2所示），损伤部位出血消失，损伤部位脊髓组织坏死，仍有大量炎性细胞浸润。损伤后4周，对照组脊髓组织变性严重，脊髓灰质结构松散，空洞形成，损伤处轴突散乱且稀少。BMSC移植组（实验I组）与过表达MicroRNA-126BMSC移植组（实验II组）损伤脊髓处空洞均有不同程度的减校实验II组空洞面积减小更为明显。图2：术后7天损伤部位脊髓组织HE染色。对照组（A）；实验I组（B）；实验II组（C）。标尺100μm4.尼氏体染色
20尼氏体染色（如图3所示）可观察到损伤后4周对照组损伤脊髓处结构紊乱，灰质白质边界不清，难以发现正常尼氏体存在。实验I组损伤脊髓处可观察到少量尼氏体，但尼氏体体积明显小于正常。实验II组可发现更多尼氏体存在，且体积较实验I组更接近正常尼氏体体积。图3：术后4周损伤部位脊髓组织尼氏体染色。对照组（A）；实验I组（B）；实验II组（C）。箭头所指为染成深蓝色的尼氏体。标尺100μm5.免疫荧光染色及定量5.1.术后脊髓内血管和巨噬细胞表达的变化为了探究BMSC移植及过表达MicroRNA-126BMSC移植对于损伤脊髓血管形成及炎症抑制的影响和两者之间的相互关系，在损伤后1天，3天和7天对损伤部位脊髓进行血管指标大鼠内皮细胞特异性抗体（RECA-1）和炎症指标小胶质细胞标记物（CD68）的双重免疫荧光染色（如图4、5、6所示）。脊髓损伤区域的边缘与正常组织交界处是血管新生的主要区域，我们将观察的重点集中在这些区域。在损伤后1天对照组可观察到少量CD68阳性细胞存在，鲜有RECA-1阳性血管。损伤后3天，对照组[（9.64±1.01）%]可见大量CD68阳性细胞，实验I组[（7.05±0.44）%]和II组[（5.72±0.62）%]可观察到炎性细胞数量显著少于对照组（P<0.01），实验II组数量最少。实验II组[（2.17±0.16）%]有最高的RECA-1阳性血管密度，实验I组[（1.81±0.21）%]和对照组[（0.89±0.11）%]阳性血管密度较低,有统计学差异（分别为P<0.05和P<0.01）。损伤后7天实验II组[（3.82±0.63）%]较实验I组[（5.62±1.02）%]和对照组[（7.91±0.60）%]有更低密度的CD68阳性细胞（分别为P<0.05和P<0.01），实验I组较对照组数量更低，差异有统计学意义（P<0.05）。实验II组[（5.01±0.41）%]具有比实验I组[（3.01±0.20）%]和对照组[（2.63±0.15）%]更高?
【参考文献】：
期刊论文
[1]急性脊髓损伤动物模型的建立与评估[J]. 吴杨鹏,范筱,张俐. 中国组织工程研究. 2016(49)
[2]不同程度脊髓背侧压迫损伤模型大鼠脊髓损伤致伤器的设计[J]. 李剑锋,冯世庆,夏润福,闫金玉. 中国组织工程研究. 2015(18)
本文编号：3027816
【文章来源】：福建医科大学福建省
【文章页数】：53 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
A:NYUImpactor-Ⅲ打击器,B:大鼠脊髓打击造模，C:大鼠造模前暴露T10段脊髓，D:打击后脊髓充血
19使用SPSS25.0进行数据分析。所有测量结果表示为平均值±标准偏差。当样本方差不等时，将Welch检验用作方差的替代分析。使用Dunnett-T检验进行单向方差分析和LSD-t检验评价组间差异。显著性定义为p<0.05的水平。结果1.实验动物情况选取的108只SD大鼠，实验过程中死亡8只，1只死于术中出血过多，5只死于麻醉过量，另外2只死于膀胱破裂，重新补充后纳入数据分析。2.分离培养鉴定骨髓间充质干细胞（BMSC）并通过慢病毒转染系统构建稳定表达过表达microRNA-126BMSC。前期已经成功完成BMSC的分离培养及鉴定，并成功构建慢病毒转染系统并已筛选出稳定表达细胞株。3.HE染色HE染色可发现对照组脊髓打击损伤后3天，受损伤处脊髓中央灰质可见大片出血、尼氏体消失、髓鞘断裂、细胞空泡样变性、部分细胞细胞核固缩、大量炎性细胞浸润，损伤周围组织出现囊腔样变化。损伤后7天（如图2所示），损伤部位出血消失，损伤部位脊髓组织坏死，仍有大量炎性细胞浸润。损伤后4周，对照组脊髓组织变性严重，脊髓灰质结构松散，空洞形成，损伤处轴突散乱且稀少。BMSC移植组（实验I组）与过表达MicroRNA-126BMSC移植组（实验II组）损伤脊髓处空洞均有不同程度的减校实验II组空洞面积减小更为明显。图2：术后7天损伤部位脊髓组织HE染色。对照组（A）；实验I组（B）；实验II组（C）。标尺100μm4.尼氏体染色
20尼氏体染色（如图3所示）可观察到损伤后4周对照组损伤脊髓处结构紊乱，灰质白质边界不清，难以发现正常尼氏体存在。实验I组损伤脊髓处可观察到少量尼氏体，但尼氏体体积明显小于正常。实验II组可发现更多尼氏体存在，且体积较实验I组更接近正常尼氏体体积。图3：术后4周损伤部位脊髓组织尼氏体染色。对照组（A）；实验I组（B）；实验II组（C）。箭头所指为染成深蓝色的尼氏体。标尺100μm5.免疫荧光染色及定量5.1.术后脊髓内血管和巨噬细胞表达的变化为了探究BMSC移植及过表达MicroRNA-126BMSC移植对于损伤脊髓血管形成及炎症抑制的影响和两者之间的相互关系，在损伤后1天，3天和7天对损伤部位脊髓进行血管指标大鼠内皮细胞特异性抗体（RECA-1）和炎症指标小胶质细胞标记物（CD68）的双重免疫荧光染色（如图4、5、6所示）。脊髓损伤区域的边缘与正常组织交界处是血管新生的主要区域，我们将观察的重点集中在这些区域。在损伤后1天对照组可观察到少量CD68阳性细胞存在，鲜有RECA-1阳性血管。损伤后3天，对照组[（9.64±1.01）%]可见大量CD68阳性细胞，实验I组[（7.05±0.44）%]和II组[（5.72±0.62）%]可观察到炎性细胞数量显著少于对照组（P<0.01），实验II组数量最少。实验II组[（2.17±0.16）%]有最高的RECA-1阳性血管密度，实验I组[（1.81±0.21）%]和对照组[（0.89±0.11）%]阳性血管密度较低,有统计学差异（分别为P<0.05和P<0.01）。损伤后7天实验II组[（3.82±0.63）%]较实验I组[（5.62±1.02）%]和对照组[（7.91±0.60）%]有更低密度的CD68阳性细胞（分别为P<0.05和P<0.01），实验I组较对照组数量更低，差异有统计学意义（P<0.05）。实验II组[（5.01±0.41）%]具有比实验I组[（3.01±0.20）%]和对照组[（2.63±0.15）%]更高?
【参考文献】：
期刊论文
[1]急性脊髓损伤动物模型的建立与评估[J]. 吴杨鹏,范筱,张俐. 中国组织工程研究. 2016(49)
[2]不同程度脊髓背侧压迫损伤模型大鼠脊髓损伤致伤器的设计[J]. 李剑锋,冯世庆,夏润福,闫金玉. 中国组织工程研究. 2015(18)
本文编号：3027816
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