YAP在支架拓扑结构和力学特性调控纤维环源干细胞分化中的作用

发布时间：2021-07-05 12:09

　　第一部分纤维环YAP蛋白区域性表达与胶原纤维直径和弹性模量的关系[摘要]目的:探讨纤维环沿径向不同区域的YAP蛋白表达及其与胶原纤维拓扑结构以及弹性模量的关系。方法:获取新西兰白兔的纤维环组织,原子力显微镜观察纤维环内、中、外三区胶原纤维直径大小,纳米压痕测试检测各区纤维环微观力学特性,免疫组化、免疫荧光以及Western Blot法检测各区细胞YAP和磷酸化YAP的表达情况。RT-qPCR检测纤维环各区细胞表型标志基因表达情况。结果:原子力显微镜扫描显示,纤维环胶原纤维呈定向排列,且内区胶原纤维直径较小,外区直径较大,中区的直径则介于内外区之间;纳米压痕测试显示由内、中到外区纤维环组织弹性模量呈递增趋势。免疫组化、免疫荧光以及Western Blot结果表明由内、中到外区YAP核转录水平逐渐增高,而磷酸化水平逐渐降低。PCR结果示Col-Ⅰ,Col5a1,Adamts17,Sfrp2,Col12a1在纤维环外区细胞中表达较高,而Col-Ⅱ和Aggrecan在纤维环内区细胞中表达较高。结论:椎间盘纤维环YAP的表达、细胞表型标志基因的表达、胶原纤维的直径及弹性模量在沿径向内、中、外区域... 

【文章来源】：苏州大学江苏省

【文章页数】：141 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

图１．天然纤维环拓扑结构、力学特性和生化组成

ＹＡＰ在支架拓扑结构和力学特性调控纤维环源干细胞分化中的作用?第一部分??毛发。于无菌条件下沿正中线切开皮肤、筋膜，紧贴着棘突的两侧切幵竖脊肌，咬除??横突并显露出Ｔ９－Ｌ５椎体，横断整个脊柱，剔除周围的肌肉和软组织，用１１号尖刀??片完整切取各节段椎间盘（图１－１?Ａ－Ｂ）。??（２）纤维环的分区：将椎间盘移至超净台上，在连续变倍体视显微镜下使用显??微外科剪去除髓核，同时去除纤维环组织周围的肌肉、筋膜、軔带组织以及碎骨片，??后将纤维环按照含水量多少分为内、中、外三个区域（图ＭＣ）。??ＰＩＨＨ??图１－１椎间盘纤维环的分离及分区。Ａ：兔Ｔ９－Ｌ６脊柱椎体及其之间的椎间盘；Ｂ：切取的完??整椎间盘组织；Ｃ：分离髓核（１）与纤维环组织，将纤维环组织按含水量大小分为内区（２）、中??区（３）以及外区（４）三区。??２．２兔纤维环组织的原子力显微镜扫描??２．２．１纤维环组织冰冻切片??（１）固定：获得完整的椎间盘组织后，快速将其置入４％的多聚甲醛固定２４小??时：??（２）脱钙：取出组织，蒸馏水冲洗３次后置入１４％的ＥＤＴＡ中脱钙３天，每天??换一次液；??（３）脱水：１５％的蔗糖脱水６小时，后置入３０％的蔗糖过夜；??（４）包埋：将组织块从蔗糖中取出迅速放置于塑料包埋盒内（直径约２?ｃｍ），??加适量ＯＣＴ包埋剂浸没组织，然后将塑料包埋盒平放入盛有液氮的小杯内，约１分??钟组织迅速凝结成块。如需要保存，则迅速以锡箔纸封包，置入－８０°Ｃ冰箱备用；??（５）切片：冻台上均匀涂抹一层ＯＣＴ包埋剂，将速冻组织置于其上，放罝于速??冻架上１０分钟。切片时温度保持在－２０°Ｃ，将载有组织块的冻台固定在切片机上．在??

学分析，所有数据都用均数±标准差（ｍｅａｎ±ＳＤ）??表示。其中蛋白表达分析、组织化学定量检测、组织细胞数量统计和胶原纤维直径分??析运用单因素方差分析，纳米压痕测试使用多因素方差分析。对于单细胞统计，每个??视野至少选取１０个样本进行统计学分析。Ｖ＜０．０５为差异有统计学意义。??二、结果??１．纤维环组织胶原纤维直径检测??原子力显微镜（ＡＦＭ）检测内、中、外三区兔纤维环组织胶原纤维直径大校??通过ＡＦＭ扫描纤维环组织表面形貌可以清楚的观察到胶原纤维直径大小以及拓扑结??构（图１－２Ａ）。统计结果得到纤维环三区的胶原纤维直径分布图（图１－２Ｂ）。结果显??示兔纤维环三区胶原纤维呈定向排列，纤维环内区的胶原纤维平均直径最小，为０．０７??［ｉｍ，外区胶原纤维平均直径较大，为０．１８叫１，而中间区的胶原纤维平均直径为０．１０??ｊｉｍ，介于内区和外区之间。??Ａ?Ｂ??０１５１?０．０７?ｐｍ???ｉＡＦ??＿＿＿霞??ｃ－ｇ？?ＣＸ?３１０?０？?ＣＭ?＆１Ｃ?ＯＨ?Ｃ？?０Ｊ３?０３４??ｉＡＦ?ｍＡＦ?ｏＡＦ?Ｆｉｂｅｒ?ｄｉａｍｅｔｅｒ?（｜ｊｍ）??图１－２纤维环内、中、外三区的原子力显微镜扫描。Ａ：天然纤维环内、中、外三区胶原纤??维ＡＦＭ扫描图像；Ｂ：内、中、外三区胶原纤维直径分布统计图。三组之间的直径大小有统计学??意义（＊＞＜０．０５，ｎ＝２００）。??２．纤维环组织的力学测试??纳米压痕测试检测兔纤维环内、中、外三区微观力学特征。通过５个不同频率检??测纤维环三区的储存模量即弹性模量（表卜１），统计结果显示纤维环内区胶原纤维有??２５??

【参考文献】：
期刊论文
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本文编号：3266048