软骨细胞通过转录因子FoxO1促进骨折愈合中血管的形成

发布时间：2021-07-10 04:13

　　软骨细胞通过产生软骨,在骨折愈合中发挥重要作用。软骨的形成稳定了骨折断端并形成骨痂,从而促进了软骨内成骨。同时,软骨细胞产生的各种生长因子在骨折的愈合过程中发挥重要作用。血管化对于骨折的修复及正常愈合是至关重要的。当血管化被抑制时会严重影响骨折修复过程并导致愈合不良,良好的血管化是骨折愈合的保证。本研究探讨了软骨细胞在骨折愈合过程中对血管化的影响以及在这一过程中转录因子Fox O1发挥的作用。实验首先利用软骨细胞内Fox O1基因敲除小鼠骨折模型,采用Micro CT,Western blot及免疫荧光法（Immunofluorescence,IF）验证了模型的成功建立并探讨软骨细胞内Fox O1敲除对小鼠骨折愈合的影响。随后采用q RT-PCR和IF检测血管化标志物CD31及血管内皮生长因子（VEGFA）的表达变化,阐述Fox O1基因对软骨内新生血管的影响。最后,在体外实验中通过利用染色质免疫共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation,Ch IP）技术及双荧光素酶报告实验（Luciferase Reporter Assay）,探讨软骨细胞内转录因子Fox O... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：91 页

【学位级别】：博士

【部分图文】：

FOXO1结构与翻译后修饰[130]

3.1 体内验证软骨细胞内 FoxO1 敲除对骨折愈合及血管生成的影响3.1.1 验证条件性基因敲除小鼠骨折模型的构建3.1.1.1 小鼠基因型的验证本实验利用 Col2 1Cre 重组酶对软骨细胞内 FoxO1 进行敲除。有文献证实Col2 1Cre 转基因模型可以特异性地删除软骨细胞中的几个固定基因，但不影响其他细胞中该基因的表达[48]。利用基因型检测对小鼠条件性基因敲除进行验证，结果结果如图 3.1 所示，在 Col2 1Cre+实验组和匹配的 Col2 1Cre-对照小鼠中均检测到具有侧翼 loxP 位点（149bp）的 FoxO1 存在，而仅在具有 Cre 重组酶的小鼠中检测到了经剪切断裂的 FoxO（1198bp）。Cre重组酶扩增子（352bp在 Col2 1Cre+实验组中表达而 Col2 1Cre-对照组小鼠中没有表达。

吉林大学博士学位论文3.1.1.2 免疫荧光法验证软骨内 FoxO1 敲除进一步对Col2 1Cre+实验组小鼠和Col2 1Cre-对照组小鼠股骨骨折标本进行组织学番红快绿染色及 FoxO1 免疫荧光检测。实验结果如图 3.2 所示，番红快绿组织学染色可以清晰的辨别骨折样本中的骨组织与软骨组织，其中软骨被染色成红色而骨组织被染色为绿色，由此可以确定该样本中软骨与骨组织的边界，确保免疫荧光实验结果的准确。免疫荧光结果显示；在 Col2 1Cre-对照组（WT）小鼠中，FoxO1 在骨组织及软骨组织内均有表达；而在 Col2 1Cre+实验组（FoxO1 KO）小鼠中，FoxO1 表达仅限于骨组织内，而在软骨组织内没有表达。该结果验证了实验组小鼠软骨内 FoxO1 的特异性敲除。


本文编号：3275162