转录因子KLF2在膝骨性关节炎中调控氧化应激影响软骨细胞功能的作用及机制研究
发布时间：2021-07-19 14:47
目的:骨关节炎（Osteoarthritis,OA）是肌肉骨骼系统中最常见的炎症性、退行性疾病之一,可导致患者明显的关节功能障碍和生活质量下降。预计OA在2020年将成为第四大致残性疾病,给患者造成严重的生活负担,并对家庭及社会造成巨大的经济负担。尽管近年来已有大量针对OA的研究,但因其病理机制复杂,目前治疗OA的临床策略任然非常有限。除了物理治疗,定期锻炼和减肥,药物干预也仅限于缓解症状。在终末期OA,人工关节置换术似乎是唯一可选择的能有效改善关节功能、提高生活质量的治疗方式。因此,只有进一步了解OA发病的分子机制,才能为寻找新的特异性治疗靶点和治疗策略提供理论依据。Kruppel样转录因子2（Kruppel-like factor 2,KLF2）是锌指类Kruppel样转录因子家族（Kruppel-like factors,KLFs）的一员,因其在调控免疫细胞功能、细胞增殖、分化中的重要作用而被广泛研究。既往研究显示KLF2与一系列炎症性疾病存在密切联系,然而关于KLF2是否与OA存在相关性以及KLF2在OA中的作用尚未被详细阐述。氧化应激被认为在OA病理发展过程中发挥重要作用。有...
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：96 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
软骨样本示例图
中国医科大学博士学位论文6骨无任何损伤或退变征象的区域。患者一般资料见附表1。2.2.2.2光滑软骨与损伤软骨样本的收集第二部分实验软骨样本包含由损伤软骨样本和光滑软骨样本组成的10对标本，每一对均来自同一例在我院行TKA的OA患者。光滑软骨样本（关节面无损伤区域）和损伤软骨样本（关节面严重受损区域）是基于Mankin评分系统来区分的[25]（图1.2）。本部分OA患者纳入标准：I符合美国风湿病学会关于膝骨关节炎的诊断标准，拟在我院行TKA患者；II术前影像学及术中观察均显示患者为明显单侧间室OA病变；III患者同意捐献标本。OA患者的排除标准：I既往痛风、风湿性关节炎或系统性红斑狼疮病史；II既往膝关节感染史或外伤史；III既往皮质类固醇药物治疗史或慢性炎症性疾病史。患者一般资料见附表2。图1.2OA患者光滑软骨样本与损伤软骨样本术中示例图。2.2.2.3OA软骨样本的收集第三部分实验软骨样本包含54例OA软骨。软骨样本均采集自在我院行TKA的OA患者。OA患者的纳入标准：I符合美国风湿病学会关于膝骨关节炎的诊断标准，拟在我院行TKA患者；II患者同意捐献标本。OA患者的排除标准：I既往痛风、风湿性关节炎或系统性红斑狼疮病史；II既往膝关节感染史或外伤史；III既往皮质类固醇药物治疗史或慢性炎症性疾病史。膝关节取材部位为股骨内、外侧髁负重区域。患者一般资料见附表3。2.2.3软骨组织总RNA的提取（1）准备工作：将抽提总RNA过程中所要用的器械和耗材放置于0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水中浸泡12个小时；高压灭菌、去除残留的DEPC水，放入烘箱中充分烘干；
中国医科大学博士学位论文12和免疫组织化学法分别检测两组样本中KLF2，MMP13及COL2A1的mRNA和蛋白表达水平。首先通过番红O染色鉴定两组软骨样本间的组织学变化。染色实验结果显示，正常组的软骨组织有较多的番红O着色，而OA软骨样本番红O着色明显少于正常组（图1.4A）。这表示OA组的软骨样本存在明显的软骨退变情况，是OA的典型病理学改变。Rt-qPCR和免疫组织化学实验结果显示，与正常软骨组织相比，OA软骨组织中KLF2的mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1.4B、C）。这一结果与上一部分的芯片分析结果一致。作为OA发生发展中的标志性蛋白，我们进一步通过Rt-qPCR和免疫组织化学法检测了两组样本中MMP-13和COL2A1的表达情况。与预期的一样，MMP-13在OA软骨组织中的mRNA和蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而COL2A1在OA软骨组织中的mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1.4B、D）。图1.4KLF2的表达水平在OA软骨组织中显著下降。A番红O/固绿染色对软骨组织样本进行组织学评价。BRt-qPCR检测软骨组织样本中KLF2、MMP-13和COL2A1的mRNA表达水平。C免疫组织化学染色检测软骨组织样本中KLF2的蛋白表达水平，右侧柱状图为Image-ProPlus定量结果。D免疫组织化学染色检测软骨组织样本中OAmarker蛋白MMP-13和COL2A1的蛋白表达水平，右侧柱状图为Image-ProPlus定量结果。数据结果均以均数±标准差的形式表示，Scalebar=200μm，*P＜0.005，**P＜0.0005。Normal：正常软骨样本组，OA：OA软骨样本组。
【参考文献】：
博士论文
[1]MicroRNA-449a调控在骨关节炎中的生物学作用及机制研究[D]. 吴建军.武汉大学 2018
本文编号：3290891
【文章来源】：中国医科大学辽宁省
【文章页数】：96 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
软骨样本示例图
中国医科大学博士学位论文6骨无任何损伤或退变征象的区域。患者一般资料见附表1。2.2.2.2光滑软骨与损伤软骨样本的收集第二部分实验软骨样本包含由损伤软骨样本和光滑软骨样本组成的10对标本，每一对均来自同一例在我院行TKA的OA患者。光滑软骨样本（关节面无损伤区域）和损伤软骨样本（关节面严重受损区域）是基于Mankin评分系统来区分的[25]（图1.2）。本部分OA患者纳入标准：I符合美国风湿病学会关于膝骨关节炎的诊断标准，拟在我院行TKA患者；II术前影像学及术中观察均显示患者为明显单侧间室OA病变；III患者同意捐献标本。OA患者的排除标准：I既往痛风、风湿性关节炎或系统性红斑狼疮病史；II既往膝关节感染史或外伤史；III既往皮质类固醇药物治疗史或慢性炎症性疾病史。患者一般资料见附表2。图1.2OA患者光滑软骨样本与损伤软骨样本术中示例图。2.2.2.3OA软骨样本的收集第三部分实验软骨样本包含54例OA软骨。软骨样本均采集自在我院行TKA的OA患者。OA患者的纳入标准：I符合美国风湿病学会关于膝骨关节炎的诊断标准，拟在我院行TKA患者；II患者同意捐献标本。OA患者的排除标准：I既往痛风、风湿性关节炎或系统性红斑狼疮病史；II既往膝关节感染史或外伤史；III既往皮质类固醇药物治疗史或慢性炎症性疾病史。膝关节取材部位为股骨内、外侧髁负重区域。患者一般资料见附表3。2.2.3软骨组织总RNA的提取（1）准备工作：将抽提总RNA过程中所要用的器械和耗材放置于0.1%的焦碳酸二乙酯（DEPC）水中浸泡12个小时；高压灭菌、去除残留的DEPC水，放入烘箱中充分烘干；
中国医科大学博士学位论文12和免疫组织化学法分别检测两组样本中KLF2，MMP13及COL2A1的mRNA和蛋白表达水平。首先通过番红O染色鉴定两组软骨样本间的组织学变化。染色实验结果显示，正常组的软骨组织有较多的番红O着色，而OA软骨样本番红O着色明显少于正常组（图1.4A）。这表示OA组的软骨样本存在明显的软骨退变情况，是OA的典型病理学改变。Rt-qPCR和免疫组织化学实验结果显示，与正常软骨组织相比，OA软骨组织中KLF2的mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1.4B、C）。这一结果与上一部分的芯片分析结果一致。作为OA发生发展中的标志性蛋白，我们进一步通过Rt-qPCR和免疫组织化学法检测了两组样本中MMP-13和COL2A1的表达情况。与预期的一样，MMP-13在OA软骨组织中的mRNA和蛋白表达水平显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。而COL2A1在OA软骨组织中的mRNA和蛋白表达水平显著降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1.4B、D）。图1.4KLF2的表达水平在OA软骨组织中显著下降。A番红O/固绿染色对软骨组织样本进行组织学评价。BRt-qPCR检测软骨组织样本中KLF2、MMP-13和COL2A1的mRNA表达水平。C免疫组织化学染色检测软骨组织样本中KLF2的蛋白表达水平，右侧柱状图为Image-ProPlus定量结果。D免疫组织化学染色检测软骨组织样本中OAmarker蛋白MMP-13和COL2A1的蛋白表达水平，右侧柱状图为Image-ProPlus定量结果。数据结果均以均数±标准差的形式表示，Scalebar=200μm，*P＜0.005，**P＜0.0005。Normal：正常软骨样本组，OA：OA软骨样本组。
【参考文献】：
博士论文
[1]MicroRNA-449a调控在骨关节炎中的生物学作用及机制研究[D]. 吴建军.武汉大学 2018
本文编号：3290891
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