缓释rhBMP-2的胶原/壳聚糖-明胶微球支架促进骨损伤修复的研究

发布时间：2021-07-23 19:25

　　目的:探讨浸提时间、乙酸浓度及料液比对鼠尾腱胶原提取的影响,建立并优化鼠尾腱胶原的提取工艺,提高胶原提取效率。构建复合重组人骨形态发生蛋白（rh BMP-2）的胶原/壳聚糖-明胶微球双缓释体系,并评价其缓释rh BMP-2的效果,及重组人骨形态发生蛋白（rh BMP-2）促进骨缺损修复的能力,为骨组织工程促进骨缺损的修复提供新的思路。方法:由于各种急慢性损伤、炎症、肿瘤、先天畸形等因素造成的骨缺损的修复是亟待解决的重大临床难题之一,骨组织工程支架为诱导骨缺损区的骨再生提供了一个崭新的治疗途径。前期研究证实重组人骨形态发生蛋白（rh BMP-2）具有良好的诱导骨再生能力,但是rh BMP-2突释效应显著且半衰期较短,与载体结合后在体内容易失去生物活性而严重影响其诱导骨再生能力。本研究选取生物活性良好的胶原及壳聚糖作为原材料制备成水凝胶载体,并制备缓释效果良好的明胶微球,将微球包埋于水凝胶中构成双缓释体系。对原材料胶原蛋白的提取工艺进行了优化,选取健康SD大鼠鼠尾,采用酸溶法提取鼠尾腱胶原,计算不同浸提时间、乙酸浓度及料液的胶原提取率,利用正交试验判断浸提时间、乙酸浓度及料液比等影响因素的... 

【文章来源】：吉林大学吉林省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：73 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
英文缩略词
第1章 绪论
    1.1 研究背景
    1.2 骨组织工程的研究现状
    1.3 本课题主要研究内容
第2章 胶原蛋白的提取、纯化及表征
    2.1 材料与仪器
        2.1.1 试剂
        2.1.2 仪器
        2.1.3 实验动物
    2.2 方法
        2.2.1 胶原蛋白的提取与纯化工艺
        2.2.2 提取工艺单因素试验
        2.2.3 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）验证胶原蛋白完整性
        2.2.4 傅里叶红外透射光谱分析胶原结构完整性
        2.2.5 氨基酸含量测定
        2.2.6 单宁酸沉淀试验验证胶原蛋白降解程度
        2.2.7 胶原凝胶的制备
        2.2.8 扫描电子显微镜观察胶原交联前后的微观结构
        2.2.9 统计学处理
    2.3 结果
        2.3.1 胶原样品观察
        2.3.2 提取工艺单因素试验
        2.3.3 正交试验结果
        2.3.4 十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）电泳实验验证胶原蛋白完整性
        2.3.5 单宁酸沉淀试验验证胶原蛋白降解程度
        2.3.6 傅里叶变换红外透射光谱（FT-IR）分析粗提物结构完整性
        2.3.7 胶原氨基酸含量测定
        2.3.8 胶原凝胶的制备
        2.3.9 胶原交联前后的扫描电镜图
    2.4 讨论
第3章 胶原/壳聚糖-明胶微球复合支架的制备及表征
    3.1 材料与仪器
        3.1.1 试剂
        3.1.2 仪器
        3.1.3 实验动物
    3.2 方法
        3.2.1 明胶微球的制备（乳化交联法）
        3.2.2 CC水凝胶及CC-GMS复合水凝胶的制备
        3.2.3 CC-GMS复合支架及GMS的微观结构表征
        3.2.4 CC水凝胶成胶时间的测定
        3.2.5 CC水凝胶降解性的测定
        3.2.6 CC水凝胶缓释rhBMP-2 的测定
        3.2.7 大鼠骨髓间充质干细胞体外分离、培养与扩增
        3.2.8 流式细胞仪测定BMSCs细胞周期
        3.2.9 BMSCs表明标记物的鉴定
        3.2.10 诱导BMSCs向成骨细胞分化
        3.2.11 诱导BMSCs向成脂细胞分化
        3.2.12 BMSCs在CC水凝胶支架中细胞活性的检测
    3.3 结果
        3.3.1 GMS粒径与外观及CC水凝胶制备
        3.3.2 CC水凝胶支架成胶时间的测定
        3.3.3 CC-GMS支架的降解性试验
        3.3.4 CC-GMS支架的体外释放试验
        3.3.5 BMSCs的形态学观察
        3.3.6 BMSCs细胞周期
        3.3.7 BMSCs表面标记物的表达
        3.3.8 BMSCs成骨、成脂诱导分化鉴定
        3.3.9 BMSCs在CC水凝胶支架中的生物学活性
    3.4 讨论
第4章 缓释BMP-2 的CC-GMS支架应用于骨缺损的修复
    4.1 材料与仪器
        4.1.1 试剂
        4.1.2 仪器
        4.1.3 实验动物
    4.2 方法
        4.2.1 载有rhBMP-2 的CC-GMS复合支架的制备
        4.2.2 原位动物实验
        4.2.3 术后大体观察及动物处死取材
        4.2.4 软X-ray检查及螺旋CT三维重建
        4.2.5 Micro CT检查
        4.2.6 组织学检查
    4.3 结果
        4.3.1 大体观察结果
        4.3.2 软X-ray检测结果
        4.3.3 螺旋CT三维重建
        4.3.4 Micro CT结果
        4.3.5 骨矿密度和骨矿含量结果
        4.3.6 组织学检查结果
    4.4 讨论
结论
参考文献
作者简介及在攻读硕士期间所取得的科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Dynamic culture of a thermosensitive collagen hydrogel as an extracellular matrix improves the construction of tissue-engineered peripheral nerve[J]. Lanfeng Huang,Rui Li,Wanguo Liu,Jin Dai,Zhenwu Du,Xiaonan Wang,Jianchao Ma,Jinsong Zhao.  Neural Regeneration Research. 2014(14)
[2]正交试验优化羊肌腱中Ⅰ型胶原蛋白提取工艺[J]. 王月宏,莎丽娜.  肉类研究. 2014(01)
[3]新型壳聚糖-胶原支架与牙周膜细胞的生物相容性[J]. 唐倩,孙文娟,黄南楠,陈茜,任力,侯思润.  中国组织工程研究. 2013(38)
[4]牙髓干细胞在组织工程研究中的应用[J]. 商丽娟,吴岩.  中国组织工程研究. 2013(19)
[5]鼠尾胶原蛋白提取、分离、纯化方法的建立及鉴定[J]. 任海涛,钟志勇,郑佳琳,饶子亮,邝少松,王刚,唐小江.  中国比较医学杂志. 2012(11)
[6]壳聚糖-胶原基可注射水凝胶制备及生物相容性检测[J]. 宋克东,刘天庆,姜波,李瑞鹏,张文,姜丽丽,马学虎,崔占峰.  大连理工大学学报. 2011(05)
[7]全骨髓贴壁法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞及其生物学特性[J]. 赵林,冯智慧,焦淑贤,李南南.  中国组织工程研究与临床康复. 2011(32)
[8]大鼠骨髓间充质干细胞的培养与鉴定[J]. 李晓峰,赵劲民,苏伟,崔向荣,罗世兴,马爱国.  中国组织工程研究与临床康复. 2011(10)
[9]梅花鹿鹿筋胶原蛋白提取工艺条件优化[J]. 张鹤,赵雨,徐云凤,李芸彤,赵大庆.  食品科学. 2010(18)
[10]壳聚糖凝胶活性载体与骨髓间充质干细胞的相容性(英文)[J]. 李忠,杨柳,戴刚,王富友,金旭红,段小军.  中国组织工程研究与临床康复. 2008(45)



本文编号：3299889