血管生成素样蛋白-2上调促进骨关节炎软骨细胞损伤机制研究

发布时间：2021-08-06 20:17

　　研究背景与目的:细胞外基质的降解与慢性低度炎症在骨关节炎（Osteoarthritis,OA）发病机制中占有重要地位。血管生成素样蛋白2（Angiopoietin-like2,ANGPTL2）可以促进细胞外基质降解,加速组织重塑并且促进慢性低度炎症,与OA的发病机制相似,但无相关研究揭示二者之间的关联。本研究的目的在于检测ANGPTL2在OA软骨中的表达差异,探究其在OA疾病中的功能及其作用机制。研究方法:首先,荧光定量PCR（q RT-PCR）,蛋白免疫印迹（western blot）和免疫组织化学（immunohistochemistry）用于检测ANGPTL2在正常软骨与OA软骨中的表达差异;从人关节软骨中分离软骨细胞,进行原代软骨细胞培养,用IL-1β刺激软骨细胞,构建OA体外细胞模型,q RT-PCR和western blot用于检测ANGPTL2在OA体外细胞模型中的表达差异。然后在体外实验中,通过敲低ANGPTL2表达与加入人工重组ANGPTL2蛋白（rh ANGPTL2）,从m RNA（q RT-PCR）和蛋白（western blot）水平检测ANGPTL2促进慢性炎... 

【文章来源】：安徽医科大学安徽省

【文章页数】：55 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

原代软骨细胞鉴定A-C细胞II型胶原免疫荧光染色

通过与 12 例正常软骨标本对比，我们发现，OA 软骨中 ANGPTL2 的mRNA 表达高于正常软骨，见图 2C。从这些软骨中取出 5 例 OA 软骨和 4 例正常软骨，提取总蛋白，通过免疫印迹技术，我们发现 OA 软骨中 ANGPTL2 的蛋白表达量同样高于正常软骨，见图 2AB。将 4 例 OA 软骨和 4 例正常软骨固定脱钙，石蜡包埋制成蜡块，切片后经过免疫组化染色，发现两种软骨由深浅至浅层，染色逐渐加深，且 OA 软骨各层染色明显较正常软骨，且主要分布于浅层，见图 2D。IL-1β刺激软骨细胞，被广泛应用于骨关节炎体外细胞模型的建立[26-28]。我们用从人膝关节软骨中分离出原代软骨细胞，传代至 P1，铺六孔板，对照组不作处理，实验组加入 IL-1β（10ng/ml）刺激，相同环境下培养 24h，收集细胞提取总蛋白或总 mRNA，经过免疫印迹实验及荧光定量 PCR 检测，我们发现，IL-1β刺激软骨细胞，ANGPTL2 表达增多，见图 2EFG。综上，ANGPTL2 在 OA 软骨病变中，表达 上调。

安徽医科大学硕士学位论文达，便于后续研究。为了检验 siRNA 的沉默效率，我们将软骨细胞铺于 6 孔板中，分为四组：1 组 control，2 组 IL-1β组，3 组 siNC+IL-1β组，4 组 siANGPTL2+IL-1β组。铺板后，待四组软骨细胞密度至 40-50%时，3 组、4 组分别转染 siNC 或siANGPTL2 至软骨细胞内，其余组予以更新培养基。四组置于相同坏境培养 24 小时后，2、3、4 组予以 IL-1β刺激，继续培养 24 小时，收集四组细胞提取总蛋白或总 mRNA。通过 WB 实验，我们发现加 IL-1β刺激后的软骨细胞 ANGTL2 蛋白表达增多，当转入 siRNA 后，这种刺激效应明显减弱，而转入 siNC 对该刺激无明显影响，见图 3A。通过荧光定量 PCR 观察 mRNA 的变化，与上述现象相似，见图 3B。由此，我们认为 siRNA 转染可有效降解 ANGPTL2 的 mRNA，沉默其蛋白表达。


本文编号：3326419