七氟烷对大鼠胚胎神经干细胞的活性、增殖、分化的影响及其可能机制研究
发布时间：2017-04-30 00:12
本文关键词：七氟烷对大鼠胚胎神经干细胞的活性、增殖、分化的影响及其可能机制研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的探讨不同浓度七氟烷对大鼠胚胎神经干细胞(Fetal neural stem cells,FNSC)的活性、增殖及分化的影响,并初步探索其机制,为临床上七氟烷运用的选择和管理提供一定的指导意义。方法购得Invitrogen公司从胚胎14天SD大鼠皮层中取出的神经干细胞,使用神经干细胞完全无血清培养基(serum free medium,SFM)进行培养,所有实验均选用第2-4代FNSC进行,选用胚胎神经干细胞标记物Nestin以及Sox2进行免疫荧光鉴定,可知培养的第4代FNSC未分化表型仍维持在90%以上。1.单层贴壁培养FNSC,随机分为4组:空白对照组(C组),即单纯吸入21%O2,5%CO2以及平衡N2未吸入七氟烷组;根据吸入七氟烷浓度不同,实验组分为:低浓度七氟烷组(SL组,吸入1.2%即0.5MAC七氟烷);中浓度七氟烷组(SM组,吸入2.4%即1MAC七氟烷);以及高浓度七氟烷组(SH组,吸入4.8%即2MAC七氟烷)。以上4组FNSC于处理6h,12h及24h后用MTT方法检测FNSC活细胞数的变化。2.利用Annexinn V/PI流式细胞术检测SH组处理不同时间(6h,12h,24h)对FNSC细胞凋亡的影响,Western blotting法检测凋亡执行蛋白cleaved caspase-3以及凋亡相关蛋白bcl-2和bax的水平,进一步明确七氟烷诱导FNSC细胞凋亡的机制。3.由于FNSC具有增殖和自我分化的特性,采用Ed U插入实验检测C组、SL组、SM组以及SH组暴露6h对FNSC增殖的影响;另一批FNSC于药物处理结束后继续培养24h,采用Sox2免疫荧光染色检测七氟烷对FNSC分化的影响。4.利用Western blotting法检测SH组处理不同时间(6h,12h,24h)后FNSC中p-JNK以及JNK蛋白表达变化,推测七氟烷对FNSC的活性、增殖、分化影响的可能机制。结果1.与C组相比,SL组处理不同时间(6h,12h,24h)后FNSC细胞活性无明显影响(P0.05);SM组24h可诱导FNSC活细胞数降低,有显著性差异(P0.0001);SH组暴露6h、12h以及24h均可诱导FNSC活细胞数降低,且呈时间依赖性,有统计学意义(P0.05)。2.与C相比,SH组处理12h、24h可诱导凋亡细胞增加,有统计学差异(P0.05),SH各时间组(6h,12h,24h)之间比较均有统计学差异(P0.05);SH24h组与C组比较cleaved caspase-3蛋白表达水平增加,12h及24h组bcl-2/bax水平降低,有统计学意义(P0.05)。3.与C组相比,SL组以及SM组暴露6h对FNSC的增殖和分化无显著影响(P0.05),而SH组6h可抑制FNSC的增殖,诱导其自发分化,差异有统计学意义(P0.001)。4.与C组相比,SH组可上调p-JNK蛋白表达水平,而对总的JNK蛋白无明显影响,p-JNK/JNK比例呈时间依赖性增加,有统计学差异(P0.05)。结论七氟烷高浓度组呈时间依赖性的诱导FNSC凋亡,并抑制其增殖,诱导其自发分化,而低、中浓度组并无此作用;七氟烷的浓度依赖性仅在细胞活力上有所体现;七氟烷对FNSC活性、增殖、分化的影响可能与激活JNK途径有关。
【关键词】：七氟烷 胚胎神经干细胞 细胞凋亡 增殖 分化
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：
- 英文缩略词表6-7
- 中文摘要7-9
- 英文摘要9-12
- 1 前言12-15
- 2 实验材料15-18
- 2.1 实验细胞15
- 2.2 实验用抗体15
- 2.3 主要试剂及配制15-17
- 2.4 实验仪器17-18
- 3 实验方法18-26
- 3.1 细胞培养18-19
- 3.2 药物处理19
- 3.3 MTT比色法19-20
- 3.4 流式FITC-Annexin V/PI法20-21
- 3.5 蛋白印迹法（Western blotting）21-24
- 3.6 Ed U插入实验24-25
- 3.7 免疫荧光染色25
- 3.8 统计分析25-26
- 4 实验结果26-31
- 4.1 大鼠胚胎神经干细胞免疫荧光检测鉴定26-27
- 4.2 七氟烷对胚胎神经干细胞活性影响的测定27
- 4.3 七氟烷诱导胚胎神经干细胞凋亡27-29
- 4.4 七氟烷对FNSC增殖的影响29-30
- 4.5 七氟烷对FNSC分化的影响30-31
- 4.6 七氟烷对JNK途径的影响31
- 5 讨论31-35
- 6 结论35-36
- 7 参考文献36-41
- 附录41-42
- 本人简历41
- 在校期间的研究成果目录41-42
- 致谢42-43
- 综述43-51
- 参考文献48-51
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1 杨小霖;Edmond Eger;Manohar Sharma;;七氟烷在小鼠中的代谢研究[J];四川医学;2012年11期
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本文编号：335884
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