转染抗菌肽基因的人脐带间充质干细胞对金黄色葡萄球菌的作用
发布时间：2021-10-17 13:24
目的本文旨在将干细胞与抗菌肽优点相结合,采用抗菌、免疫调节和感染创面修复综合治疗,为创面金黄色葡萄球菌感染的治疗提供新方法。具体地说,本实验采用人脐带间充质干细胞（hUC-MSCs）作为种子细胞,将抗菌肽LL-37通过转基因技术转染到细胞内,检测抗菌肽LL-37在hUC-MSCs中的基因表达状况,并证实经转染抗菌肽LL-37后的干细胞释放出外分泌物质,其培养上清液对金黄色葡萄球菌具备较强的抑菌效应,目的是为临床上有效治疗、合理应用非抗生素类的抗感染药奠定理论基础。方法1.采取组织分离法提取细胞后,传代、冻存、复苏等常规方法培养h UC-MSCs,每次换液时应用倒置显微镜观察所培养的细胞形态变化特点。2.将提取完成的hUC-MSCs应用流式细胞仪进行鉴定,检验是否符合干细胞的细胞免疫表型。3.构建和包装慢病毒载体用于搭载抗菌肽LL-37基因,并且选用荧光法测定慢病毒的滴度值。4.选取处于对数生长期的hUC-MSCs进行细胞分组,标记为3组,进行转染携带抗菌肽LL-37慢病毒载体的hUC-MSCs标记为实验组;进行转染未携带抗菌肽LL-37空载慢病毒载体的hUC-MSCs标记为空载体组;未...
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
过表达慢病毒克隆的制备过程简述（1）先将载体进行酶切、消化，收获已经线性化的载体先配制包含内切酶Buffer、纯化质粒DNA等的酶切体系，用移液器吹打而后离
材料与方法9流程图2利用293T细胞收获慢病毒、包装、检测选用荧光法测定慢病毒的滴度：（1）首先，在滴度测定的前一天进行铺板，使用293T细胞铺到96孔的孔板内，每孔加入细胞数量约为4×104个，且为100μL体积；（2）准备好灭菌的Ep管10个,在各Ep管内分别加入培养液90μL（此处不含血清）；（3）取出第1个灭菌的Ep管，管内加入10μL待测定的病毒原液，混匀后，再取出第2个管，管内加入10μL，以同样的操作进行下去，完成最后1个Ep管为止；（4）依据所需要的细胞选择孔，弃掉孔内90μL的培养液，把稀释好的病毒液加入孔内，体积为90μL，而后放置在培养箱里即可；（5）24h后，为避免细胞吹起，小心加入完全培养液100μL；（6）96h后，使用荧光显微镜观察荧光状况。2.4实验分组及转染2.4.1实验分组选择细胞并分组时，选取目前处于对数生长期的hUC-MSCs，PBS溶液洗涤2遍以后，使用0.25%胰酶（含EDTA）消化，时间约1min，而后加入同等体积的完全培养液终止，离心后，使用完全培养液重悬细胞，而且使用计数板进行计数，按
青岛大学硕士学位论文10照细胞密度5×107个/L接种于12孔板中，放置在温度为37℃并且体积分数为5%CO2细胞培养箱中过夜，培养至细胞融合密度约为30%，此时随机分为3个组别，而且每个组设置为3个复孔。①进行转染携带抗菌肽LL-37慢病毒载体的hUC-MSCs标记为实验组；②进行转染未携带抗菌肽LL-37空载慢病毒载体的hUC-MSCs标记为空载体组；③未进行转染等特殊处置、常规换液培养的hUC-MSCs标记为对照组。2.4.2转染[15]方法根据预实验的结果判断，将病毒的滴度进行稀释，使滴度为1×1011TU/L便于操作，12孔板中每孔加入慢病毒30μL及感染增强液20μL，放置在温度设为37℃并且体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，待12~24h根据细胞状态进行换液，转染时间长度达到72h后，为了清晰观察慢病毒载体携带的绿色荧光(GFP)表达状况可以使用荧光显微镜，当观察荧光率超过80%时表明此次转染成功，否则，需要进行重新转染直到达标为止。平均每3d进行换液处理一次，并且待细胞达到85%~90%，可以传代培养，使用嘌呤霉素筛选稳转株。换液时，收集细胞的培养上清液，并且按照15:1的比例用Ultra-15超滤管进行浓缩，并且使用过滤器（0.22μm）将上清液进行除菌，除菌完毕，将其保存至-80℃低温冰箱，以备用于抑菌实验使用。可以多次进行分组及转染获取各组细胞及细胞培养上清液，充足获取以用于实验。2.5Westernblot方法检测（见流程图3）应用Westernblot方法[16]进行检测各组别的抗菌肽LL-37蛋白表达情况，结果以LL-37蛋白条带光密度/内参光密度值表达。流程图3通过Westernblot方法做LL-37蛋白水平的过表达检测
【参考文献】：
期刊论文
[1]三叶因子-3对甲状腺乳头状癌细胞增殖及迁移作用的研究[J]. 郑晓春,张婷婷,吴靖芳,张文静,张静,王保芝. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2015(13)
[2]不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究[J]. 潘晓倩,成晓瑜,张顺亮,乔晓玲,陈文华. 肉类研究. 2014(12)
[3]Mesenchymal stem cells: Emerging mechanisms of immunomodulation and therapy[J]. Justin D Glenn,Katharine A Whartenby. World Journal of Stem Cells. 2014(05)
[4]重症烧伤患者医院感染病原学及耐药性分析[J]. 庞久玲,马征,刘爱东,高小英,李冰,刘悦. 中华医院感染学杂志. 2014(06)
[5]骨科感染创面病原菌菌谱及耐药情况分析[J]. 王万忠. 中国病原生物学杂志. 2013(09)
[6]酶标比浊法评价月桂酸单甘油酯对肉葡萄球菌的抑菌活性[J]. 翁佩芳,江华珍,冯凤琴,张辉. 中国食品学报. 2012(05)
本文编号：3441835
【文章来源】：青岛大学山东省
【文章页数】：51 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
过表达慢病毒克隆的制备过程简述（1）先将载体进行酶切、消化，收获已经线性化的载体先配制包含内切酶Buffer、纯化质粒DNA等的酶切体系，用移液器吹打而后离
材料与方法9流程图2利用293T细胞收获慢病毒、包装、检测选用荧光法测定慢病毒的滴度：（1）首先，在滴度测定的前一天进行铺板，使用293T细胞铺到96孔的孔板内，每孔加入细胞数量约为4×104个，且为100μL体积；（2）准备好灭菌的Ep管10个,在各Ep管内分别加入培养液90μL（此处不含血清）；（3）取出第1个灭菌的Ep管，管内加入10μL待测定的病毒原液，混匀后，再取出第2个管，管内加入10μL，以同样的操作进行下去，完成最后1个Ep管为止；（4）依据所需要的细胞选择孔，弃掉孔内90μL的培养液，把稀释好的病毒液加入孔内，体积为90μL，而后放置在培养箱里即可；（5）24h后，为避免细胞吹起，小心加入完全培养液100μL；（6）96h后，使用荧光显微镜观察荧光状况。2.4实验分组及转染2.4.1实验分组选择细胞并分组时，选取目前处于对数生长期的hUC-MSCs，PBS溶液洗涤2遍以后，使用0.25%胰酶（含EDTA）消化，时间约1min，而后加入同等体积的完全培养液终止，离心后，使用完全培养液重悬细胞，而且使用计数板进行计数，按
青岛大学硕士学位论文10照细胞密度5×107个/L接种于12孔板中，放置在温度为37℃并且体积分数为5%CO2细胞培养箱中过夜，培养至细胞融合密度约为30%，此时随机分为3个组别，而且每个组设置为3个复孔。①进行转染携带抗菌肽LL-37慢病毒载体的hUC-MSCs标记为实验组；②进行转染未携带抗菌肽LL-37空载慢病毒载体的hUC-MSCs标记为空载体组；③未进行转染等特殊处置、常规换液培养的hUC-MSCs标记为对照组。2.4.2转染[15]方法根据预实验的结果判断，将病毒的滴度进行稀释，使滴度为1×1011TU/L便于操作，12孔板中每孔加入慢病毒30μL及感染增强液20μL，放置在温度设为37℃并且体积分数为5%CO2细胞培养箱中培养，待12~24h根据细胞状态进行换液，转染时间长度达到72h后，为了清晰观察慢病毒载体携带的绿色荧光(GFP)表达状况可以使用荧光显微镜，当观察荧光率超过80%时表明此次转染成功，否则，需要进行重新转染直到达标为止。平均每3d进行换液处理一次，并且待细胞达到85%~90%，可以传代培养，使用嘌呤霉素筛选稳转株。换液时，收集细胞的培养上清液，并且按照15:1的比例用Ultra-15超滤管进行浓缩，并且使用过滤器（0.22μm）将上清液进行除菌，除菌完毕，将其保存至-80℃低温冰箱，以备用于抑菌实验使用。可以多次进行分组及转染获取各组细胞及细胞培养上清液，充足获取以用于实验。2.5Westernblot方法检测（见流程图3）应用Westernblot方法[16]进行检测各组别的抗菌肽LL-37蛋白表达情况，结果以LL-37蛋白条带光密度/内参光密度值表达。流程图3通过Westernblot方法做LL-37蛋白水平的过表达检测
【参考文献】：
期刊论文
[1]三叶因子-3对甲状腺乳头状癌细胞增殖及迁移作用的研究[J]. 郑晓春,张婷婷,吴靖芳,张文静,张静,王保芝. 临床耳鼻咽喉头颈外科杂志. 2015(13)
[2]不同检测方法在抗菌肽抑菌效果评价的比较研究[J]. 潘晓倩,成晓瑜,张顺亮,乔晓玲,陈文华. 肉类研究. 2014(12)
[3]Mesenchymal stem cells: Emerging mechanisms of immunomodulation and therapy[J]. Justin D Glenn,Katharine A Whartenby. World Journal of Stem Cells. 2014(05)
[4]重症烧伤患者医院感染病原学及耐药性分析[J]. 庞久玲,马征,刘爱东,高小英,李冰,刘悦. 中华医院感染学杂志. 2014(06)
[5]骨科感染创面病原菌菌谱及耐药情况分析[J]. 王万忠. 中国病原生物学杂志. 2013(09)
[6]酶标比浊法评价月桂酸单甘油酯对肉葡萄球菌的抑菌活性[J]. 翁佩芳,江华珍,冯凤琴,张辉. 中国食品学报. 2012(05)
本文编号：3441835
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