化脓性链球菌SLO对破骨细胞分化及其功能影响的研究

发布时间：2021-10-23 04:52

　　背景骨骼是一个不断生长、修复损伤、调节体内钙和磷酸盐代谢的动态器官。骨感染是骨科领域的严重并发症。破骨细胞是骨骼系统中唯一具有骨吸收能力的细胞。骨感染如细菌性关节炎、骨髓炎和内植物相关感染可导致破骨细胞过度激活,导致病理性骨质破坏,引起骨折延迟不愈合和不愈合。化脓性链球菌（GAS）是引起骨感染的最重要的细菌之一,可引起化脓性关节炎和骨髓炎等相关骨感染,并导致关节和骨的炎性破坏。近年来化脓性链球菌引起骨感染不断增加,了解GAS与骨相互作用对于治疗抗生素耐药性和持续感染的新型治疗策略的发展至关重要。链球菌溶血素O（SLO）是化脓性链球菌分泌的一种标志性毒素,大多数临床GAS分离株可以检测到该毒素,并且其在侵袭性感染中过度表达。然而,SLO在GAS诱发的骨质破坏中的确切作用很大程度上仍然未知。目的因此本次课题以Raw 264.7细胞作为破骨细胞前体,采用RANKL+M-CSF作为诱导因子,建立体外诱导破骨细胞分化模型,探索化脓性链球菌溶血素O是否影响OC的分化、细胞融合以及骨吸收能力;并进一步在mRAN及蛋白水平探索OC分化标志基因的表达及其有关蛋白通路的改变。方法以RANKL+M-CSF为... 

【文章来源】：中国人民解放军陆军军医大学重庆市

【文章页数】：48 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

破骨细胞分化染色鉴定

图 2 Real Time PCR 反应设置参数3.2.6 Western blotting 检测 c-fos 和 NFATc1 蛋白表达（1）蛋白质提取1）复苏细胞，并放置于恒温孵箱中培养，待细胞分裂至占培养瓶面积约 80%时，用细胞刮轻柔刮下细胞。2）用新鲜培养基调整细胞浓度，轻柔吹打，使细胞充分混匀后，接种于 6 孔板（1ml）上，每孔加 1ml。放入培养箱中孵育。3）孵育 10h 后，观察 6 孔板内细胞贴壁生长良好，细胞分布均匀，且细胞形态大多呈圆形，将孔内培养基更换为添加了不同浓度化脓性链球菌溶血素O（0、1、2.5μg/ml）的培养基，继续在 37℃、5%CO2 条件下培养孵育，48h 后更换细胞因子、培养基、溶血素 O.4）72h 后，按 IP 细胞裂解液:PMSF=99:1 的比例配制蛋白提取液，置于冰上备用。5）去除培养板内的培养基，用 PBS 清洗后，每孔加入 80μl 蛋白提取液，用细胞刮刮脱下细胞，分别收集至 1.5ml 离心管内，置于冰上裂解 30 分钟。

24图 4 溶血素 O 抑制 RANKL 诱导的 Raw264.7 细胞骨吸收活性的影响。 A：溶血素 O 抑制OCs 的骨吸收活性及减少骨吸收陷窝的形成。 B:各组吸收面积百分比比较。3.3.3 SLO 抑制 OCs 分化标志基因的表达TRAP 阳性多核细胞可以表达破骨细胞特异基因如 TRAP,MMP9,Integrinβ3CTR,ATP6v60d 及 DC-STAMP。在试验中，可以观察到 RANKL 组中上述标志性基因表达量比空白对照组明显上升，这在 mRNA 水平上说明我们成功建立了体外诱导体系加入 SLO（0.25、0.5、1、2.5μg/ml）诱导破骨细胞后，破骨细胞分化相关特异基因的表达明显减少(图 5)。

【参考文献】：
期刊论文
[1]重庆市收治的汶川地震截肢伤员调查分析[J]. 杨志金,舒彬,曾登芬.  重庆医学. 2009(05)



本文编号：3452504