携带热休克蛋白90α功能性F-5基因的慢病毒转染人脐带间充质干细胞治疗糖尿病大鼠创面的实验研究

发布时间：2022-07-15 14:28

　　目的:通过构建携带热休克蛋白90α功能性F-5基因的慢病毒载体,并用慢病毒转染人脐带间充质干细胞,来探索热休克蛋白90α功能性F-5基因结合人脐带间充质干细胞对糖尿病大鼠慢性创面的治疗效果,并验证其有效性,为治疗糖尿病慢性创面提供新的有效的治疗手段及方法,为临床上应用休克蛋白90α功能性F-5基因表达产物治疗糖尿病创面提供新的思路。方法:1、携带热休克蛋白90αF-5基因的过表达慢病毒载体的制备、病毒包装与滴度检测:首先需要构建携带目的基因的载体质粒,可以选择含有绿色荧光蛋白基因和抗药物筛选基因的工具载体GV358,将事先经过PCR扩增的目的基因片段交换入线性表达载体,并在感受态细胞中完成转化,最终获取质粒。获取质粒后进行阳性克隆PCR鉴定,用以确定质粒含有目的基因片段;并用蛋白印迹法检测质粒的目的基因是否能正常表达对应蛋白。上述制备好的工具载体质粒GV358与辅助质粒Helper1.0、Helper2.0一起,转染293T细胞,完成病毒的包装。通过反复离心的方式收获病毒、浓缩纯化病毒;并用通过观察物理指标、滴度指标,对病毒质量进行检测。2、携带F-5基因慢病毒转染人脐带间充质干细胞（... 

【文章页数】：106 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
材料与方法
    第一部分 :携带热休克蛋白90α“F-5”基因的过表达慢病毒载体的制备、病毒包装与滴度检测
        1.材料与设备
        2.携带热休克蛋白90α功能性F-5基因的质粒构建
        3.蛋白质印记法(Western Blot)检测质粒HSP90AA1 的表达
        4.慢病毒包装
    第二部分 携带“F-5”基因慢病毒转染人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)
        1.材料
        2.人脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)的培养、传代及冻存
        3.慢病毒转染后细胞相关指标测定
    第三部分 关于糖尿病创面愈合的动物实验研究
        1.主要试剂和仪器
        2.实验动物
        3.实验方法
    第四部分 统计学分析
结果
    1.携带热休克蛋白90α“F-5”基因的过表达慢病毒质粒的构建
    2.慢病毒包装与滴度测定
    3.hUC-MSCs的特征
    4.慢病毒转染hUC-MSCs
    5.糖尿病大鼠外观状态观察
    6.大鼠血糖的变化情况
    7.糖尿病大鼠创面模型外观形态观察
    8.创面愈合情况评估
    9.HE染色病理切片的观察
    10.免疫组织化学染色法观察创面组织VEGFR2、eNOS的表达情况
讨论
结论
参考文献
综述
    综述参考文献
攻读学位期间的研究成果
缩略词表
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]Recent advances on the association of apoptosis in chronic non healing diabetic wound[J]. Awadhesh K Arya,Richik Tripathi,Santosh Kumar,Kamlakar Tripathi.  World Journal of Diabetes. 2014(06)
[2]人脐带间充质干细胞治疗大鼠糖尿病神经性足溃疡的疗效及VEGF表达变化[J]. 王瑛,但齐琴,王庆萍,周宁,金醒眆,侯宗柳,彭葆坤,王廷华.  四川大学学报(医学版). 2014(01)
[3]人脐带干细胞移植对大鼠糖尿病足及BDNF表达的影响[J]. 王瑛,周宁,王庆萍,金醒眆,侯宗柳,彭葆坤,但齐琴,王廷华.  四川大学学报(医学版). 2013(06)
[4]Trends in prevalence of diabetes in Asian countries[J]. Ambady Ramachandran,Chamukuttan Snehalatha,Ananth Samith Shetty,Arun Nanditha.  World Journal of Diabetes. 2012(06)



本文编号：3662222