人羊膜间充质干细胞在体内外对小鼠巨噬细胞表型及IL-10表达的影响研究

发布时间：2017-05-17 03:07

  本文关键词：人羊膜间充质干细胞在体内外对小鼠巨噬细胞表型及IL-10表达的影响研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:探讨人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,h AMSCs)在体内外对小鼠巨噬细胞表型及IL-10表达的影响,求证h AMSC是否具有调控小鼠巨噬细胞表型转化及促进IL-10表达的作用,以完善h AMSC促进创面愈合的机制研究,为进一步转化到临床提供基础研究资料。方法:1、采用胰酶-胶原酶二步消化法分离h AMSCs,差速贴壁,DMEM培养基培养、纯化,传代至P4代,MTT法检测细胞存活的OD值,绘制培养1-7天生长曲线,采用流式细胞仪鉴定并成脂及成骨诱导分化培养h AMSCs。2、腹腔灌洗法提取10只C57BL/6野生小鼠腹腔巨噬细胞,DMEM培养液调整细胞浓度至1×105个/m L,每孔1m L接种于6孔培养板,去除未贴壁细胞后使用含INF-γ(M1型巨噬细胞诱导剂)的DMEM培养基2m L培养,细胞吞噬试验鉴定。3、小鼠腹腔巨噬细胞培养5天后移除6孔板内含INF-γ的DMEM培养基,设立h AMSCs共培养组及单独培养组,每组3孔,h AMSCs共培养组每孔加入1×104个P4代h AMSCs(h AMSCs巨噬细胞比为1:10)后予DMEM培养基2m L培养,单独培养组予DMEM培养基2m L培养。ELISA法于共培养后1天、7天检测各组上清液中IL-12(M1型巨噬细胞型分泌)、Arg-I(M2型巨噬细胞型分泌)及IL-10含量。4、取56只雄性健康C57BL/6野生小鼠建立背部全层皮肤缺损模型,剔除小鼠背部毛发,在脊柱两侧分别设计并切除10mm×10mm大小正方形全层皮肤。设立h AMSCs移植组及对照组,每组28只,h AMSCs移植组小鼠于每个背部创面周围多点皮下注射以DMEM培养基配制浓度为1×106个/100μL的P4代h AMSCs细胞悬液100μL,对照组小鼠于每个背部创面注射100μL DMEM培养基。5、取2只雄性健康C57BL/6野生小鼠建立背部全层皮肤缺损模型,创面周围多点注射100μL细胞密度为1×106个/100μL CM-Dil标记的h AMSCs细胞悬液,14天后切取创面组织,荧光显微镜下对移植h AMSCs进行示踪。6、小鼠背部皮肤缺损模型建立后1天、3天、7天、14天观察各组小鼠创面愈合情况,测量创面面积,计算每组各个时间点愈合率。并于以上各时间点扩大切取创面组织,组织石蜡切片HE染色观察炎性细胞的浸润情况;冰冻切片免疫荧光双染色分别观察组织中CD68与i NOS双阳性(M1型巨噬细胞)、CD68与Arg-I双阳性(M2型巨噬细胞)表达情况;q PCR检测创面组织抗炎因子IL-10基因的表达情况。结果:1、采用胰酶-胶原酶二步消化法可获得大量稳定增殖的h AMSCs。h AMSCs原代接种48h可见细胞贴壁生长,P4代h AMSCs细胞生长曲线呈“S”形,3-5天呈指数生长期,然后进入平台期,细胞停止增殖。流式细胞鉴定:细胞表面CD73(98.1%)、CD90(96.7%)、CD105(95.1%)呈阳性,CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR阴性(0.5%)。细胞成脂诱导培养21天后行油红O染色可见红色脂滴,成骨诱导培养21天后行茜素红染色可见红色钙化结节。2、小鼠腹腔巨噬细胞呈圆形或椭圆形、梭形、不规则形,细胞表面伸出许多刺毛状小突起,并对墨汁颗粒具有吞噬作用,吞噬百分率为85%。3、ELISA法检测h AMSCs共培养组1天、7天上清液IL-12浓度分别为43.36±1.93ng/L、22.22±1.47ng/L,Arg-I浓度分别为5.48±1.38 U/L、12.52±0.46 U/L,IL-10浓度分别为65.35±5.99 ng/L、220.69±7.11ng/L;单独培养组1天、7天上清液IL-12浓度分别为42.74±2.42ng/L、33.08±1.10ng/L,Arg-I浓度分别为5.13±0.48 U/L、6.07±0.13U/L;IL-10浓度分别为62.48±2.17 ng/L、75.54±7.50 ng/L。可见第7天h AMSCs共培养组上清液IL-12浓度较巨噬细胞单独培养组低,而上清液中Arg-I、IL-10含量较巨噬细胞单独培养组高(P0.05)。4、h AMSCs移植组1天、3天、7天、14天创面愈合率分别为(1.23±0.39)%、(33.93±2.71)%、(75.17±3.69)%、(98.14±1.66)%;对照组1天、3天、7天、14天创面愈合率分别为(1.11±0.11)%、(27.29±3.41)%、(62.37±5.24)%(95.46±2.56)%。可见h AMSCs移植组创面3天、7天、14天创面愈合率优于对照组(P0.05)。5、h AMSCs移植后14天所取组织冰冻切片于荧光显微镜观察可见h AMSCs移植组中存在散在荧光分布,提示局部移植的h AMSCs在建模14天后依旧存活。6、HE染色观察可见h AMSCs移植组创面3天、7天炎性细胞浸润相对模型对照组少。7、免疫荧光染色结果显示h AMSCs移植组1天、3天、7天、14天的CD68与i NOS双阳性细胞百分比分别是(36.84±5.52)%、(32.73±3.56)%、(18.17±1.33)%、(5.41±2.19)%,CD68与Arg-I双阳性细胞百分比分别是(2.08±1.04)%、(30.18±4.13)%、(38.74±3.71)%、(21.01±1.75)%;模型对照组1天、3天、7天、14天的CD68与i NOS双阳性细胞百分比分别是(37.29±6.78)%、(43.97±2.98)%、(23.31±2.51)%、(6.51±1.28)%,CD68与Arg-I双阳性细胞百分比分别是(1.59±1.54)%、(23.58±1.66)%、(31.06±2.61)%、(18.71±1.58)%。可见h AMSCs移植组M1型巨噬细胞阳性率在3天、7天低于模型对照组,M2型巨噬细胞阳性率在3天、7天高于模型对照组(P0.05)。8、q PCR检查结果显示小鼠背部皮肤全层缺损模型建立后h AMSCs移植组1天、3天、7天、14天创面组织IL-10基因相对GAPDH基因表达量分别为0.0152±0.0025、0.2827±0.0133、0.0535±0.0054、0.0209±0.0055;模型对照组1天、3天、7天、14天创面组织IL-10基因相对GAPDH基因表达量分别为0.0127±0.0021、0.1208±0.0043、0.0326±0.0046、0.0148±0.0021。可见对照组及模型组相比3天、7天h AMSCs移植组创面组织IL-10的基因表达高于模型对照组(P0.05)。结论:1、h AMSCs具有促进小鼠M1型巨噬细胞向M2型转化的作用;2、h AMSCs具有促进小鼠皮肤创面愈合的生物学效应,其可能部分与h AMSCs促进创M1型巨噬细胞向M2型巨噬细胞转化,上调创面局部IL-10的表达,抑制创面炎症反应有关。
【关键词】：人羊膜间充质干细胞 巨噬细胞 IL-10 创面愈合
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R641
【目录】：

• 中英缩略词对照表4-5
• 中文摘要5-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-13
• 实验材料13-15
• 实验方法15-22
• 结果22-37
• 讨论37-39
• 结论39-40
• 参考文献40-42
• 综述42-50
• 参考文献47-50
• 致谢50-51
• 作者简介51

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本文编号：372415