肾上腺素能受体活化促肝脏生物支架再细胞化的作用及其机制研究

发布时间：2017-05-18 16:08

  本文关键词：肾上腺素能受体活化促肝脏生物支架再细胞化的作用及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：一、背景肝脏疾病迁延至终末期普遍会导致肝功能衰竭。肝移植是目前国际公认的治疗肝功能衰竭最有效的方法。但供体肝脏数量不足成为限制肝移植发展最大的问题。全器官灌注法制备的肝脏生物支架以及再细胞化肝脏具有特殊的生物学优势,有望将来替代终末期衰竭的肝脏,解决供体肝脏不足的问题。但目前再细胞化肝脏与正常肝脏相比仍有较大差距,再细胞化肝脏多途径模拟正常肝脏的培养微环境是目前研究的热点。交感神经是肝脏重要的组成部分并调节肝脏各项生理、病理的过程,特别是在肝脏的修复与再生中发挥了重要的作用。本课题组前期的研究已证实阻断交感神经可降低肝脏再生的速率。然而,交感神经递质是否对肝脏生物支架再细胞化具有调节作用,还未见文献报道。二、目的明确不同肾上腺素能受体激动剂对肝脏生物支架内细胞增殖的作用,以及对再细胞化肝脏的影响,探讨肾上腺素能受体亚型活化后发挥相应作用的相关分子机制,为完善再细胞化肝脏的制备与培养提供新的科学依据。三、方法1.使用全器官灌注法制备C57小鼠肝脏生物支架,行苏木精伊红染色和Massion染色,检测肝脏生物支架内DNA残留量,明确肝脏生物支架制备的效果;多步灌注法制备再细胞化肝脏,行免疫荧光化学检验,明确再细胞化肝脏内细胞生长情况。2.使用RT-PCR和免疫荧光化学的方法检测种子细胞(L02细胞)肾上腺素能受体及亚型AR-α1A、AR-α1B、AR-α1D、AR-α2A、AR-α2B、AR-α2C、AR-β1、AR-β2、AR-β3的表达情况。3.使用Cell Titer-Blue的检测方法检测瓶皿培养下不同交感神经递质及肾上腺素能受体激动剂对L02细胞增殖的作用;使用Click-iT Plus Edu的检测方法检测肝脏生物支架内肾上腺素能受体活化对L02细胞增殖、粘附的作用,鉴定其再细胞化的效果。4.使用elisa的方法检测肾上腺素能受体活化对再细胞化肝脏内白蛋白分泌和尿素合成水平的影响,明确其对再细胞化肝脏功能的促进作用。5.使用rt-pcr的方法检测tnf-α、il-6、icam-1、ngf和tgf-β细胞因子的表达,使用westernblot的方法检测smad3、stat3、p38、jnk-1和akt-1关键信号蛋白的表达,阐明肾上腺素能受体亚型活化促进再细胞化肝脏内细胞增殖的分子机制。四、结果1.全器官灌注法成功制备肝脏生物支架。体视显微镜下可清晰观察到肝小叶内的微脉管系统,肝脏生物支架(114.027±5.526ng/mg)和正常肝脏(9450.087±234.387ng/mg)dna含量之间具有显著性差异,he染色观察到肝脏生物支架内基本看不到蓝染的细胞核,并且保留了基本的生物骨架结构,massion染色观察到肝脏生物支架内含有大量纤维蛋白和弹性蛋白成分。成功运用全器官灌注法制备再细胞化肝脏。he染色观察到细胞稳定附着于支架内,massion染色观察到再细胞化肝脏内有大量正常细胞和细胞外基质成分。激光共聚焦显微镜观察到细胞数量随培养时间而增长。2.l02细胞膜表面表达多种肾上腺素能受体及其亚型。rt-pcr检测发现ar-α1d和ar-β2受体亚型表达相对较高,而ar-α1a和ar-α2b几乎不表达,其余的受体亚型均有一定程度的表达。细胞免疫荧光化学染色观察到ar-β2受体亚型的表达量相对较高。3.ar-β2受体亚型活化后可以促进瓶皿培养以及肝脏生物支架内的l02细胞增殖,并促进再细胞化肝脏白蛋白分泌和尿素合成。4.在ar-β2受体亚型活化调节再细胞化肝脏的过程中,通过rt-pcr筛选多种信号分子发现il-6表达升高并具有显著性差异,而tnf-α、icam-1、ngf、tgf-β表达没有变化。5.在ar-β2受体亚型活化调节再细胞化肝脏的过程中,通过westernblot检验了多个关键信号蛋白,发现stat3蛋白及磷酸化stat3蛋白的表达显著增强,而smad3、p38、jnk-1和akt-1蛋白的表达没有显著变化。表明il-6/stat3信号通路的激活对β2受体活化后肝脏生物支架内l02细胞增殖具有关键作用,进而提升再细胞化肝脏白蛋白分泌和尿素合成。五、结论本研究证实了交感神经递质可以显著促进肝脏生物支架再细胞化,其机制是通过AR-β2受体亚型活化调节IL-6/Stat3信号通路促进肝脏生物支架内肝细胞的增殖。
【关键词】：肝脏生物支架 再细胞化肝脏 肾上腺素能受体 组织工程
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R657.3;R318.08
【目录】：

• 缩略语表4-6
• 英文摘要6-9
• 中文摘要9-12
• 第一章 前言12-14
• 第二章 肝脏生物支架和再细胞化肝脏的制备14-26
• 2.1 材料和方法14-20
• 2.2 结果20-24
• 2.3 讨论24-26
• 第三章 不同交感神经递质对肝脏生物支架内肝细胞增殖的作用26-45
• 3.1 材料和方法26-33
• 3.2 结果33-43
• 3.3 讨论43-45
• 第四章 肾上腺素能受体活化介导IL-6/Stat3信号通路促肝细胞增殖45-54
• 4.1 材料和方法45-50
• 4.2 结果50-53
• 4.3 讨论53-54
• 全文总结54-55
• 参考文献55-60
• 文献综述 肝脏生物支架内干细胞参与肝再生的研究与临床应用60-71
• 参考文献66-71
• 攻读学位期间的研究成果71-72
• 致谢72

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