LncRNA在椎间盘退变过程中调控髓核细胞凋亡的功能及其机制研究

发布时间：2017-06-04 12:10

  本文关键词：LncRNA在椎间盘退变过程中调控髓核细胞凋亡的功能及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：【目的】椎间盘的老化和退变是脊柱退变性疾病发生的前提条件和病理基础,理解椎间盘老化和退变的生物学机制,开发有效的治疗干预措施以应对椎间盘退变带来的健康问题已经成为当前和未来全球性医学难题之一。本研究通过生物信息学分析筛选髓核细胞凋亡调控相关的lncRNA,进而探索lncRNA在椎间盘退变过程中髓核细胞凋亡调控的分子机制,从而为寻找椎间盘退变性疾病治疗的新靶点提供科学指导。【方法】1、比较三种生物信息学分析软件,应用TargetScan软件筛选可能通过miR-155参与髓核细胞凋亡调控的lncRNA。2、RT-PCR检测髓核细胞转染miR-155 mimics后lncRNA表达调控情况,通过lncRNA及mRNA芯片检测评估髓核细胞转染miR-155过表达慢病毒后lncRNA及mRNA表达谱变化,评估miR-155作为基因治疗靶点可能对髓核细胞功能产生的影响。3、流式细胞分析检测过表达GAS5 lncRNA后髓核细胞的凋亡情况,Western Blot检测线粒体通路上两个关键凋亡相关蛋白Caspase-3和Bcl-2的表达,验证GAS5 lncRNA对髓核细胞凋亡调控的影响,探索GAS lncRNA参与髓核细胞凋亡调控的可能机制。【结果】1、退变椎间盘髓核组织内共有631个表达上调的lncRNA序列信息较为明确,其中有148个上调的lncRNA包含了178个hsa-miR-155-5p结合位点。符合Target Scan评分标准的lncRNA有16个,NR_002819含有6个hsa-miR-155-5p结合位点,ENST00000511037、NR_027451包含了5个结合位点,19个lncRNA包含了2个结合位点,126个lncRNA包含了1个结合位点。2、GAS5 lncRNA包含了1个hsa-miR-155-5p结合位点,外源性导入hsa-miR-155 mimics 72小时后,髓核细胞GAS5 lncRNA表达较阴性对照组明显下降(P0.05)。lncRNA及mRNA表达谱芯片分析共发现721个差异表达lncRNA(Fc值≥2,P0.05),其中492个lncRNA表达上调,229个lncRNA表达下调。芯片检测的18个GAS5 lncRNA转录本均表达下调,仅有GAS5-021表达具有显著差异(Fc值≥1.5,P0.05)。Gene Ontology分析显示,髓核细胞在miR-155过表达后基因表达发生了明显的改变,主要集中在肿瘤、免疫性疾病、退变性疾病及心血管疾病等领域,其中以强直性脊柱炎及滑膜炎与椎间盘的关系最为密切。3、GAS5 lncRNA过表达慢病毒转染96小时后,髓核细胞GAS5 lncRNA的表达水平提高(P0.05),凋亡蛋白酶Caspase-3表达上调,凋亡抑制蛋白Bcl-2表达下调,髓核细胞的凋亡率较阴性对照组明显升高(P0.05)。【结论】lncRNA在退变椎间盘髓核细胞凋亡调控中起到了重要作用,GAS5 lncRNA过表达使得髓核细胞内线粒体凋亡通路上的两个关键蛋白家族成员的表达均发生了变化,通过下调Bcl-2和上调Caspase-3的表达,GAS5 lncRNA激活了髓核细胞内的线粒体凋亡通路,进而促进髓核细胞的凋亡。GAS5 lncRNA在细胞内监管着线粒体凋亡途径中促凋亡和抑凋亡分子之间的平衡,GAS5 lncRNA的表达状态决定了细胞对凋亡刺激的敏感性。miR-155可能参与了GAS5 lncRNA的凋亡调控过程,两者的相互调控机制有待进一步的研究。
【关键词】：LncRNA 椎间盘退变 髓核细胞 细胞凋亡 线粒体凋亡通路 生物信息学分析
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R681.5
【目录】：

• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-12
• 前言12-14
• 第一部分 TargetScan筛选退变椎间盘髓核细胞凋亡相关lncRNA的研究14-20
• 一、前言14-16
• 二、材料与方法16-17
• （一）获取lncRNA序列信息16
• （二）miRNA研究情况及其序列信息16
• （三）TargetScan预测靶lncRNA16-17
• （四）筛选目标lncRNA17
• 三、结果17-18
• 四、讨论18-20
• 第二部分 hsa-miR-155 过表达髓核细胞lncRNA及mRNA表达谱芯片研究20-33
• 一、前言20-21
• 二、材料与方法21-26
• （一）椎间盘髓核细胞培养21
• （二）外源性hsa-miR-155 mimics及对照组双链RNA合成21-22
• （三）髓核细胞转染hsa-miR-155 mimics及对照组双链RNA22
• （四）RT-PCR检测转染hsa-miR-155 mimics后髓核细胞GAS5 lncRNA的表达22-24
• （五）hsa-miR-155 过表达慢病毒构建24-25
• （六）hsa-miR-155 过表达慢病毒转染髓核细胞25
• （七）hsa-miR-155 过表达后髓核细胞lncRNA及mRNA芯片检测分析25-26
• 三、结果26-31
• （一）人椎间盘髓核细胞生长状况26
• （二）hsa-miR-155 过表达后髓核细胞GAS5 lncRNA表达下降26-27
• （三）hsa-miR-155 过表达慢病毒转染后髓核细胞生长状况27
• （四）样品RNA芯片分析质检结果27-28
• （五）hsa-miR-155 过表达后髓核细胞lncRNA及mRNA芯片分析结果28-29
• （六）has-miR-155 过表达后髓核细胞GAS5 lncRNA各转录本检测及表达29-31
• 四、讨论31-33
• 第三部分 GAS5 lncRNA调控椎间盘髓核细胞凋亡的功能机制研究33-40
• 一、前言33
• 二、材料与方法33-36
• （一）GAS5 lncRNA过表达慢病毒构建及转染33-34
• （二）GAS5 lncRNA过表达慢病毒转染髓核细胞后RT-PCR检测GAS5 lncRNA的表达34
• （三）蛋白质抽提及western blot检测34-35
• （四）流式细胞仪检测髓核细胞凋亡率35-36
• 三、结果36-38
• （一）GAS5 lncRNA过表达慢病毒转染髓核细胞后GAS5 lncRNA表达上调36
• （二）髓核细胞过表达GAS5 lncRNA后Caspase-3 及Bcl-2 蛋白表达变化36-37
• （三）髓核细胞过表达GAS5 lncRNA后细胞凋亡率增加37-38
• 四、讨论38-40
• 全文总结40-41
• 综述 GAS5 lncRNA在细胞生长抑制及凋亡中的作用机制及其研究进展41-49
• 参考文献49-57
• 在读期间发表论文和科研工作情况57-58
• 致谢58-59

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  本文关键词：LncRNA在椎间盘退变过程中调控髓核细胞凋亡的功能及其机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

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本文编号：420931