低强度振动载荷协同多孔钛合金对长骨骨缺损修复的作用效果及机制研究

发布时间：2017-06-06 16:19

  本文关键词：低强度振动载荷协同多孔钛合金对长骨骨缺损修复的作用效果及机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：骨缺损是矫形外科的常见病和难治病,其发病原因包括疾病、外伤和某些手术并发症。自体骨移植对于较小的缺损区域是临床治疗的金标准,但对于大量的骨缺损病患,患者自身骨量不足,影响预后。异体骨移植有较大的抗原反应和感染风险。骨替代材料一直是骨移植的重要选择。钛合金是一种重要的骨移植替代材料。但传统的钛合金骨整合效果较差,力学属性不理想。近年来,随着3D打印技术的发展,多孔钛合金(porou titanium alloy,p Ti)越来越多的被应用于临床,为骨缺损的金属材料修复提供了新思路。相比于传统钛合金,pTi具有与骨小梁更相近的结构特征,多孔结构本身能为骨骼中的组织液传输提供有效的孔隙通道。但是,由于钛是惰性金属,pTi只能与骨组织以机械铆合的形式结合,而非稳定的化学键结合方式,因此仍难以实现早期快速的骨整合,骨缺损修复的效率和质量仍受到限制。低强度全身振动载荷(Low-level whole-body vibration,WBV)是一种安全、经济、非侵入的物理因子作用方式,不同参数的WBV刺激对动物和人体骨骼具有显著的调控作用。国内外的大量实验研究证明,WBV能够有效抑制由废用和绝经导致的骨质疏松,减缓骨量流失,提高骨强度,预防骨折的发生。而一些临床研究也证实,WBV能够显著提高正常人群和骨质疏松患者的全身骨量,调控机体的骨转换。同时,诸多临床前实验也证实WBV能够显著促进骨折愈合。但是,WBV是否能够提高pTi的骨整合及骨长入效果,进而提高骨缺损修复效率和修复质量,国内外尚未见相关的文献报道。在本研究中,首先,我们通过体外实验探索了wbv对于pti中的成骨细胞结构、细胞生物学行为、成骨活性以及成骨相关重要基因和蛋白表达的影响;然后,我们通过体内实验系统探索wbv协同pti对于兔长骨骨缺损的修复效果及其潜在的作用机制。本研究旨在系统揭示wbv对于pti骨整合和骨再生的影响及其体内外作用机制,从而为骨缺损的修复提供新思路,同时还有望降低临床骨缺损的修复治疗成本,改善骨缺损病患的生活质量。本课题的研究不但具有重要的科学研究参考价值,还具有重要的临床应用价值。整个课题主要分为以下两个部分:实验一:wbv对pti中的兔原代成骨细胞行为和功能的影响及机制研究方法:通过cad技术设计出多孔结构的三维模型(12mm×2.5mm圆片,孔隙率约70%,孔隙直径约1mm),导入3d打印系统,通过电子束熔融技术将ti-6al-4v粉末逐层熔融凝固,制成pti材料,经过超声清洗、高温高压灭菌后,作为实验用pti。提取新西兰兔原代成骨细胞作为种子细胞,种植于pti内部,施加一定时间的wbv刺激。分别通过mtt法检测细胞增殖,通过dapi染色和电镜观察细胞在pti表面的粘附情况,通过fitc染色观察细胞骨架情况。提取总rna和总蛋白通过qrt-pcr和western-blot方法检测成骨相关基因和蛋白的表达。结果:mtt结果显示wbv显著促进了成骨细胞在pti表面的增殖(p0.05);dapi染色和扫描电镜结果显示实验组成骨细胞在材料表面的附着数量和细胞伪足数量都显著多于对照组;fitc细胞骨架荧光染色结果表明实验组pti表面粘附的细胞数量多于对照组(p0.05),实验组细胞可伸展出更多的微丝附着于pti表面(p0.05);qrt-pcr结果显示wbv显著上调了成骨相关基因和经典wnt信号通路基因的表达,western-blot结果显示wbv显著上调了成骨相关蛋白和经典wnt信号通路蛋白的表达。结论:wbv刺激可以显著加快pti内部成骨细胞的增殖,提高成骨细胞在pti表面的粘附效果,上调细胞内成骨相关基因和蛋白的表达。实验二:wbv协同pti对兔长骨缺损修复的作用效果及机制研究方法:通过cad技术设计出多孔结构的三维模型(6mm×8mm圆柱体,孔隙率约70%、孔隙直径约1mm),导入3d打印系统,通过电子束熔融技术将ti-6al-4v粉末逐层熔融凝固,制成pti材料,经过超声清洗、60co辐照灭菌后,作为实验用种植体。雌性新西兰大耳白兔24只,体重3.0±0.4kg,肌肉注射3%戊巴比妥钠溶液(1ml/kg)和盐酸赛拉嗪注射液(0.1ml/kg)麻醉,在左侧股骨外侧髁位置制作深8mm,直径6mm圆柱形骨缺损区域,填充pTi。术后1周,将实验动物按体重分为实验组(pTi+WBV)和对照组(pTi),实验组每天施加WBV(30Hz,0.5g)1h,对照组不做任何处理。分别在WBV刺激6周、12周后随机对每组半数实验动物取材。取材前分两次注射8%钙黄绿素溶液(1ml/kg)。样本进行X线正、侧位片检查,Micro-CT检查,荧光双标分析,Masson染色,qRT-PCR检测,甲苯胺蓝染色。结果:X线正、侧位片显示骨缺损造模过程中pTi的种植位置正确;Micro-CT检查结果显示在6周、12周WBV刺激后,实验组pTi与骨组织整合情况要优于对照组,实验组BV/TV、Tb.N均高于对照组(P0.05),BS/BV、Tb.Sp均低于对照组(P0.05);Masson染色结果显示实验组骨长入情况优于对照组;荧光双标结果显示,实验组的矿化沉积率(MAR)、矿化面积比(MS/BS)和骨形成率(BFR/BS)均高于对照组;qRT-PCR结果显示,经过6周、12周WBV刺激,实验组成骨相关基因ALP、OCN、Runx2、BMP2、OPG表达均显著高于对照组(P0.05),Sost与RANKL基因表达均显著低于对照组(P0.05),经典Wnt信号通路基因Wnt3a,Lrp6和β-catenin均显著高于对照组(P0.05);甲苯胺蓝染色结果显示实验组成骨细胞数量多于对照组。结论:WBV能够提高pTi骨整合效果,改善pTi骨组织附着和长入。在微观层面上改善了骨组织和植入体的整合,从而改善骨缺损的修复效果,提高了pTi的稳定性,避免了松动和炎症的发生。
【关键词】：全身振动载荷 多孔钛合金 成骨细胞 骨缺损
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R68
【目录】：

• 缩略语表6-8
• 中文摘要8-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文献回顾17-31
• 实验一 WBV对PTI中的兔原代成骨细胞行为和功能的影响及机制研究31-49
• 1 材料31-32
• 1.1 实验动物31
• 1.2 实验试剂及耗材31
• 1.3 实验仪器31-32
• 2 方法32-40
• 2.1 兔原代成骨细胞的提取32-33
• 2.2 成骨细胞的观察和鉴定33-34
• 2.2.1 成骨细胞的镜下观察33
• 2.2.2 ALP染色33
• 2.2.3 茜素红S染色33-34
• 2.3 三维pTi圆片的制作34
• 2.4 对成骨细胞施加WBV刺激34-35
• 2.5 WBV对成骨细胞形态的影响35-36
• 2.5.1 扫描电镜下pTi表面成骨细胞的形态35-36
• 2.5.2 免疫荧光染色观察pTi表面细胞形态36
• 2.6 WBV对成骨细胞增殖的影响36-37
• 2.7 WBV对成骨细胞成骨相关信号通路的影响37-40
• 2.7.1 WBV对成骨相关基因的影响37-38
• 2.7.2 WBV对成骨相关蛋白的影响38-40
• 2.8 统计学分析40
• 3.结果40-47
• 3.1 原代成骨细胞的提取40
• 3.2 原代成骨细胞的鉴定40-41
• 3.3 pTi圆片的制作结果41-42
• 3.4 WBV的施加效果42-43
• 3.5 WBV对成骨细胞粘附影响结果43-44
• 3.6 WBV刺激对成骨细胞形态影响结果44-45
• 3.7 WBV对pTi表面细胞增殖的影响结果45
• 3.8 WBV对成骨相关信号通路的表达的影响结果45-47
• 4 讨论47-49
• 实验二 WBV协同PTI对兔长骨缺损修复的作用效果及机制研究49-64
• 1 材料49-50
• 1.1 实验动物49
• 1.2 实验仪器及耗材49
• 1.3 实验试剂49-50
• 2 方法50-54
• 2.1 多孔结构pTi的制备50
• 2.2 骨缺损动物模型的制备50
• 2.3 WBV的施加及样本处理50-52
• 2.4 取材及样本处理52
• 2.5 Micro-CT检查52
• 2.6 硬组织切片检查52-53
• 2.7 Masson染色分析53
• 2.8 成骨相关基因检查53
• 2.9 成骨细胞染色观察53-54
• 2.10 统计学分析54
• 3 结果54-62
• 3.1 pTi种植体制作情况54
• 3.2 骨缺损造模结果54-55
• 3.3 样本X线检查结果55-56
• 3.4 Micro-CT检查结果56-57
• 3.5 荧光双标检查结果57-58
• 3.6 Masson染色结果58-59
• 3.7 qRT-PCR检查结果59-61
• 3.8 骨小梁表面成骨细胞染色结果61-62
• 4 讨论62-64
• 小结64-65
• 参考文献65-82
• 个人简历和研究成果82-84
• 致谢84

  本文关键词：低强度振动载荷协同多孔钛合金对长骨骨缺损修复的作用效果及机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：426885