依普黄酮对人骨关节炎软骨生物学、生物力学性能作用的体外研究

发布时间：2017-06-28 15:07

  本文关键词：依普黄酮对人骨关节炎软骨生物学、生物力学性能作用的体外研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:1、研究Indian hedgehog(Ihh)信号通路抑制剂—依普黄酮(ipriflavone,IP)是否可以阻止骨关节炎(osteoarthritis,OA)软骨细胞的肥大分化及软骨组织的降解,从而缓解OA;2、研究IP对OA软骨细胞增殖、凋亡的影响,从而为治疗OA提供实验依据;3、运用微管吸吮技术,研究Ihh(力学敏感基因)通路抑制剂—IP是否可改善OA软骨细胞的生物力学性能。方法:1、选取因OA进行膝关节置换而截下的outbridge评分1-2分的胫骨平台关节软骨,消化成软骨细胞进行细胞培养、切成4mm3大小进行软骨组织块培养;2、采用荧光免疫的方法鉴定软骨细胞表型,以确定所培养的细胞为软骨细胞;3、软骨细胞、软骨组织块实验均分为DMSO空白组、IP低浓度组、IP高浓度组;4、于IP干预2天培养后细胞进行RT-q PCR,检测SMO、Gli-1、Gli-2、Gli-3(Ihh信号通路指标)、Runx-2、MMP-13(软骨细胞肥大指标)及COL II、Aggrecan(软骨代谢指标);细胞进行Western Blotting,检测COL II、MMP-13、COL X蛋白的变化;5、于IP干预2天培养后采用CCK-8、Ed U及流式方法检测IP对OA软骨细胞增殖、凋亡的影响情况;6、于IP干预2天培养后,细胞进行微管吸吮,观察IP对OA软骨细胞生物力学性能的影响。7、IP干预OA软骨组织块2天后石蜡切片番红O-固绿染色,高倍镜下观察蛋白多糖的变化,并进行组织学Mankin评分;进行免疫荧光染色,检测COL II、Runx-2、COL X蛋白表达的变化;结果:1、软骨细胞表型鉴定:细胞免疫荧光染色显示,所培养的软骨细胞I型胶原(COL I)染色为阴性,II型胶原(COL II)的染色为阳性,可以确定从软骨组织中分离的细胞为软骨细胞;2、IP通过抑制Ihh信号通路对OA软骨细胞的肥大分化及细胞代谢影响的RT-q PCR结果:IP药物组Ihh信号通路指标SMO、Gli-1、Gli-2、Gli-3及软骨细胞肥大分化指标Runx-2、MMP-13的m RNA较DMSO空白组表达水平下降(P0.05),软骨细胞代谢指标Aggrecan(蛋白多糖)、COL II的m RNA水平较DMSO对照组显著增高(P0.05);3、IP可以促进OA软骨Col II蛋白表达,抑制MMP-13、COL X蛋白表达:IP干预OA软骨细胞2天后,Western Blotting结果表明,IP药物组OA软骨细胞的Col II蛋白表达明显多于DMSO对照组,MMP-13、COL X(软骨细胞肥大分化的OA指标)表达较DMSO对照组更少,灰度值半定量结果有统计学意义(P0.05);4、IP对OA软骨细胞增殖、凋亡的影响:首先用CCK-8检测增殖情况,实验结果发现细胞培养第3天、第4天时,IP药物组的细胞增殖明显高于DMSO对照组(P0.05);针对细胞第3天的增殖结果,采用Ed U染色验证了CCK-8检测增殖的结果;流式方法测IP对OA软骨细胞凋亡的影响结果发现,细胞培养第3天,IP药物组的软骨细胞凋亡率相对DMSO对照组均显著降低(P0.05);5、微管吸吮分析IP对OA软骨细胞生物力学特性的影响:人OA软骨细胞表现为典型的黏弹性固体蠕变特征,细胞瞬时模量(E0)、平衡模量(E∞)、表观黏性(μ)较正常软骨细胞均升高,但用IP药物干预后,OA软骨细胞的E0、E∞、μ明显降低,生物力学性能得到改善(P0.05);6、IP体外干预人OA软骨组织块2天后番红O-固绿染色显示IP对OA软骨组织块蛋白多糖的影响:IP药物干预人OA软骨组织块后,IP药物组软骨组织块相对DMSO对照组其软骨细胞更多、蛋白多糖(PG)染色更深;组织学Mankin评分DMSO对照组、IP低浓度组、IP高浓度组3组分别为8.34±0.58,4.67±0.57(P0.01),2.34±0.28(P0.001),分数越低,OA软骨退变越轻;7、免疫荧光染色显示IP对OA软骨组织块相关蛋白表达的影响:IP体外干预人OA软骨组织块2天后的免疫荧光染色显示,IP药物组软骨组织块的Col II明显多于DMSO对照组,Runx-2、COL X表达较DMSO对照组更少。可见,IP可以促进OA软骨组织块Col II表达,抑制Runx-2、COL X表达,从而缓解软骨组织块的降解。结论:Ihh通路抑制剂—依普黄酮(IP)在细胞水平及拟在体的组织块水平证实可以抑制Ihh信号通路,进而阻止OA软骨细胞的肥大分化及软骨组织的降解,从而对OA时的软骨具有保护作用;同时,IP也可以促进OA软骨细胞的增殖,抑制其凋亡,改善体外培养OA软骨细胞的生物力学性能,在OA治疗方面具有积极意义。因此,IP可能具有治疗OA的作用。
【关键词】：indian hedgehog 骨关节炎 依普黄酮 细胞肥大 增殖 凋亡 生物力学
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684.3
【目录】：

• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 常用缩写词中英文对照表12-13
• 前言13-15
• 1 材料与方法15-34
• 1.1 一般资料15-17
• 1.2 研究方法17-33
• 1.3 统计学处理33-34
• 2 结果34-42
• 2.1 人OA软骨细胞的形态学观察及表型鉴定34
• 2.2 IP对OA软骨细胞Ihh信号通路及细胞肥大分化基因影响的RT-PCR结果34-35
• 2.3 IP可以促进OA软骨细胞Col II蛋白表达，抑制MMP-13、COL X蛋白表达35-36
• 2.4 IP对OA软骨细胞增殖、凋亡的影响36-37
• 2.5 微管吸吮分析IP对OA软骨细胞力学特性的影响37-38
• 2.6 番红O-固绿染色显示IP对OA软骨组织块蛋白多糖的影响38-39
• 2.7 IP体外干预人OA软骨组织块2天后的免疫荧光染色39-42
• 3 讨论42-46
• 3.1 Ihh通路抑制剂—IP对OA软骨细胞肥大分化及软骨组织降解的影响42-43
• 3.2 IP对OA软骨细胞增殖、凋亡的影响43
• 3.3 IP对OA软骨细胞生物力学性能的影响43-44
• 3.4 其他的Ihh信号通路抑制剂及相关治疗药物44
• 3.5 不足及展望44-46
• 4 结论46-47
• 参考文献47-49
• 综述49-60
• 参考文献55-60
• 致谢60-61
• 在学期间承担/参与的科研课题与研究成果61-63
• 个人简历63

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本文编号：494267