蛋白激酶Cα相互作用蛋白1调控AMPA受体在瑞芬太尼痛觉过敏中的机制研究

发布时间：2017-07-02 14:17

  本文关键词：蛋白激酶Cα相互作用蛋白1调控AMPA受体在瑞芬太尼痛觉过敏中的机制研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：作为一种μ-阿片受体激动剂,瑞芬太尼能够快速起效与清除,并且不发生蓄积,因而在临床麻醉时得到广泛青睐。但瑞芬太尼痛觉过敏的发生概率明显高于其他阿片类药物,这在很大程度上限制了瑞芬太尼的临床应用,阐明其机制有助于制订预防其诱发痛觉过敏的措施。前期有研究证实,在瑞芬太尼所致痛觉过敏的发生和维持这一过程中,NMDA受体活化-钙离子内流增多-PKC激活这一系列反应所介导的脊髓中枢敏化参与其中。NMDA受体与AMPA受体,两者均是兴奋性谷氨酸离子通道型受体。上述两种受体大量分布于脊髓背根神经节及其背角浅层。两者的功能相似,参与上传疼痛信号,并且介导形成脊髓中枢敏化。而蛋白激酶Cα相互作用蛋白1(PICK1)在人和动物的组织中均有表达,是蛋白激酶Cα(protein kinase Cα,PKCα)的靶蛋白之一,也是在PKCα和突触后膜AMPA受体蛋白间起重要作用的衔接蛋白。且有研究发现,PICK1参与了炎症诱发的痛觉过敏的形成和维持。但PICK1在瑞芬太尼痛觉过敏时对于AMPA受体的运输和表达的影响未见报道。因此本研究拟探讨PICK1及AMPA受体亚单位运输的变化及调节在瑞芬太尼痛觉过敏形成机制中的作用。第一部分:瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓PICK1表达水平的变化目的通过评价瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓PICK1表达水平的变化,探讨PICK1在瑞芬太尼引发痛觉过敏中的可能机制。方法SPF级雄性SD大鼠16只,体重240~260g,42~49日龄,尾静脉置管成功后,采用随机数字表法分为2组(n=8):瑞芬太尼组(R组):按1.2μg·kg-1·min-1的标准给大鼠输注瑞芬太尼(经尾静脉),输注时间为60min;对照组(C组):经尾静脉置管输注等体积的生理盐水0.12 ml·kg-1·min-1,输注时间为60min。分别于生理盐水或瑞芬太尼输注前24h、停止输注后2、6、24和48 h时测定机械缩足反应阈(PWT)和热缩足潜伏期(PWL)。于输注后48 h测定痛阈后处死大鼠,取L4~6节段脊髓,采用RT-qPCR法测定PICKl mRNA表达水平,采用Western blot法测定PICKl蛋白表达水平。结果R组PWT降低、PWL缩短(P0.05)。且R组PICK1 m RNA及蛋白表达水平均升高(p0.05)。结论输注瑞芬太尼导致了痛觉过敏;瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓pick1mrna及蛋白表达水平上调,这种改变有可能与形成瑞芬太尼痛觉过敏有关。第二部分:瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓ampa受体亚单位表达及运输水平的变化目的通过测定大鼠发生瑞芬太尼痛觉过敏时,脊髓组织中ampa受体亚单位表达水平的改变以及对其运输情况的影响,从而探究该受体亚单位的表达水平以及运输改变是否以及如何参与瑞芬太尼所致的痛觉过敏。方法spf级雄性sd大鼠16只,体重240~260g,42~49日龄,尾静脉置管成功后,采用随机数字表法分为2组(n=8):瑞芬太尼组(r组):按1.2μg·kg-1·min-1的标准给大鼠输注瑞芬太尼(经尾静脉);对照组(c组):经尾静脉置管输注生理盐水0.12ml·kg-1·min-1,输注时间为60min。分别于生理盐水或瑞芬太尼输注前24h、停止输注后2、6、24和48h测定机械缩足反应阈(pwt)和热缩足潜伏期(pwl)。于输注后48h测定痛阈后处死大鼠,取l4~6节段脊髓,采用免疫荧光染色法观察脊髓背角glur1、glur2、glur3阳性细胞的表达。采用westernblot法测定脊髓细胞膜(s)及胞浆内(i)ampa受体glur1、glur2及glur3亚单位的表达。结果与c组比较,r组pwt降低、pwl缩短(p0.05)。且r组脊髓背角glur1、glur3亚单位阳性细胞表达增多,glur2表达减少(p0.05);sglur1、sglur3表达增加,sglur2表达减少(p0.05),iglur1、iglur2和iglur3表达无明显变化(p0.05)。结论输注瑞芬太尼导致了大鼠的痛觉过敏;大鼠发生瑞芬太尼痛觉过敏时,其脊髓组织中的ampa受体glur2阳性细胞表达减少,glur1、glur3亚单位阳性细胞表达增多;glur1、glur3向细胞膜转运增加、glur2向胞浆内化增加,该变化可能参与了瑞芬太尼痛觉过敏形成的机制。第三部分:pick1反义寡核苷酸对大鼠瑞芬太尼痛觉过敏时脊髓组织中ampa受体亚单位表达及运输水平的变化的影响目的通过pick1反义寡核苷酸敲低大鼠脊髓pick1蛋白的表达水平,评价pick1对于瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓ampa受体glur1、glur2、glur3亚单位表达及运输的变化的影响。方法:parta:spf级雄性sd大鼠96只,体重240~260g,42~49日龄,采用随机数字表法分为3组(n=32):对照组(NS组)、PICK1反义寡核苷酸组(AS组)、PICK1错义寡核苷酸组(MS组)。三组均鞘内置管:NS组经鞘内置管给予10μl生理盐水;AS组经鞘内置管给予10μg/10μl PICK1反义寡核苷酸(ASDON),MS组经鞘内置管给予10μg/10μl PICK1错义寡核苷酸(MSDON)。每日给药1次,连续4d。第5d~8d每天随机处死4只大鼠,取脊髓L4-6节段,采用western blot法测定脊髓PICK1蛋白表达水平的变化。Part B:确定经鞘内置管给的反义寡核苷酸起作用后,分别取NS组、AS组的剩余大鼠进行尾静脉置管,随机分为4组(n=8):NS+R组和AS+R组分别经尾静脉置管输注瑞芬太尼1.2μg·kg-1·min-160 min;NS+NS组和AS+NS组分别经尾静脉置管输注与瑞芬太尼等容量生理盐水60min(速率为0.12 ml·kg-1·min-1)。分别于生理盐水或瑞芬太尼输注前24h、停止输注后2、6、24和48 h时测定PWT、PWL。于输注后48 h时测定痛阈后处死大鼠,取L4~6节段脊髓,采用免疫组化染色法观察脊髓背角GluR1、GluR2、GluR3亚单位阳性细胞的表达。采用western blot法测定脊髓细胞膜(s)及胞浆内(i)AMPA受体GluR1、GluR2及GluR3亚单位的表达。结果与NS+NS组比较,NS+R组和AS+R组PWT降低、PWL缩短(P0.05);脊髓背角GluR1、GluR3亚单位阳性细胞表达增多、GluR2表达减少(P0.05);sGluR1、s GluR3表达增加,sGluR2表达减少(P0.05),iGluR1和iGluR2表达无明显变化(P0.05)。与NS+R组比较,AS+R组PWT升高、PWL延长(P0.05);脊髓背角GluR1亚单位阳性细胞表达无明显改变(P0.05),GluR3阳性细胞表达降低,GluR2表达增多(P0.05);sGluR3表达降低,sGluR2表达增多(P0.05)。sGluR1、iGluR1、iGluR2和iGluR3表达无明显变化(P0.05)。结论PICK1通过调节脊髓组织中AMPA受体的GluR2、GluR3这两个亚单位,影响其表达和运输,介导瑞芬太尼痛觉过敏的过程,而其对GluR1亚单位在表达和运输并无影响。
【关键词】：瑞芬太尼 痛觉过敏 PICK1 AMPA受体 反义核苷酸 运输
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-15
• 缩略语/符号说明15-18
• 前言18-21
• 研究现状、成果18-19
• 研究目的、方法19-21
• 一、瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓PICK1表达水平的变化21-38
• 1.1 对象和方法21-31
• 1.1.1 实验材料21-23
• 1.1.1.1 实验动物21
• 1.1.1.2 实验仪器及耗材21-22
• 1.1.1.3 主要实验试剂22-23
• 1.1.1.4 主要试剂制备23
• 1.1.2 实验方法23-31
• 1.1.2.1 实验动物分组23
• 1.1.2.2 大鼠尾静脉置管23-24
• 1.1.2.3 行为学测定24-25
• 1.1.2.4 大鼠腰断脊髓标本的采集25
• 1.1.2.5 RT-qPCR检测瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓PICK1的mRNA水平变化25-27
• 1.1.2.6 Western Blot检测瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓PICK1的蛋白水平变化27-30
• 1.1.2.7 统计学分析30-31
• 1.2 结果31-33
• 1.2.1 瑞芬太尼输注后大鼠热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足阈值(PWT)的变化31-32
• 1.2.2 各组大鼠腰段脊髓mRNA及蛋白表达水平变化32-33
• 1.3 讨论33-37
• 1.3.1 瑞芬太尼的痛觉过敏现象33
• 1.3.2 瑞芬太尼痛觉过敏的动物实验依据33-34
• 1.3.3 瑞芬太尼痛觉过敏的研究现状34-35
• 1.3.4 动物模型的建立35-36
• 1.3.4.1 尾静脉置管35
• 1.3.4.2 瑞芬太尼输注的剂量选择35
• 1.3.4.3 研究中时间点的选择35
• 1.3.4.4 行为学测定35-36
• 1.3.5 PICK136-37
• 1.3.5.1 PICK1的分子结构36
• 1.3.5.2 PICK1的分布及生物学功能36
• 1.3.5.3 PICK1与RIH36-37
• 1.4 小结37-38
• 二、瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体亚单位表达及运输水平的变化38-46
• 2.1 对象和方法38-40
• 2.1.1 实验材料38
• 2.1.1.1 实验动物38
• 2.1.1.2 实验仪器及耗材38
• 2.1.1.3 主要实验试剂38
• 2.1.1.4 主要试剂制备38
• 2.1.2 实验方法38-40
• 2.1.2.1 实验动物分组38
• 2.1.2.2 大鼠尾静脉置管38-39
• 2.1.2.3 行为学测定39
• 2.1.2.4 大鼠腰断脊髓标本的采集39
• 2.1.2.5 免疫荧光染色检测瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体Glu R1、GluR2、GluR3亚单位的表达39
• 2.1.2.6 Western Blot检测瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体GluR1、GluR2、GluR3亚单位的运输变化39-40
• 2.1.2.7 统计学分析40
• 2.2 结果40-42
• 2.2.1 瑞芬太尼输注后大鼠热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足阈值(PWT)的变化40
• 2.2.2 各组大鼠腰段脊髓AMPA受体Glu R1、GluR2、Glu R3亚单位在脊髓背角的表达情况40-42
• 2.2.3 各组大鼠腰段脊髓AMPA受体Glu R1、GluR2、Glu R3亚单位在脊髓背角的运输情况42
• 2.3 讨论42-45
• 2.3.1 AMPA受体亚单位的表达及运输42-45
• 2.4 小结45-46
• 三、PICK1反义寡核苷酸对瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓AMPA受体表达及运输水平的变化的影响46-62
• 3.1 对象和方法46-49
• 3.1.1 实验材料46
• 3.1.1.1 实验动物46
• 3.1.1.2 实验仪器及耗材46
• 3.1.1.3 主要实验试剂46
• 3.1.1.4 主要试剂制备46
• 3.1.2 实验方法46-49
• 3.1.2.1 实验动物分组及实验流程46-47
• 3.1.2.2 大鼠鞘内置管47-48
• 3.1.2.3 运动功能测试48
• 3.1.2.4 大鼠尾静脉置管48
• 3.1.2.5 行为学测定48
• 3.1.2.6 大鼠腰断脊髓标本的采集48
• 3.1.2.7 Western Blot检测Part A大鼠脊髓PICK1的蛋白水平变化48
• 3.1.2.8 免疫荧光染色检测Part B大鼠脊髓AMPA受体Glu R1、GluR2、GluR3亚单位的表达48-49
• 3.1.2.9 Western Blot检测Part B大鼠脊髓AMPA受体GluR1、GluR2、GluR3亚单位的运输变化49
• 3.1.2.10统计学分析49
• 3.2 结果49-56
• 3.2.1 大鼠鞘内置管后运动功能测试结果49
• 3.2.2 大鼠鞘内置管注入 2%利多卡因结果49
• 3.2.3 大鼠鞘内置管给药后PICK1蛋白的表达49-51
• 3.2.4 瑞芬太尼输注后大鼠热刺激缩足潜伏期(PWL)和机械刺激缩足阈值(PWT)的变化51-52
• 3.2.5 各组大鼠腰段脊髓AMPA受体Glu R1、GluR2、Glu R3亚单位在脊髓背角的表达情况52-54
• 3.2.6 各组大鼠腰段脊髓AMPA受体Glu R1、GluR2、Glu R3亚单位在脊髓背角的运输情况54-56
• 3.3 讨论56-61
• 3.3.1 反义寡核苷酸技术56-57
• 3.3.2 鞘内置管技术57
• 3.3.3 PICK1反义寡核苷酸对于PICK1蛋白表达水平的影响57-58
• 3.3.4 PICK1反义寡核苷酸对于瑞芬太尼痛觉过敏大鼠的行为学的影响58
• 3.3.5 PICK1反义寡核苷酸对于瑞芬太尼痛觉过敏大鼠的脊髓AMPA受体的表达和运输的影响58-59
• 3.3.6 PICK1与AMPA受体亚单位的表达及运输的研究现状59-61
• 3.4 小结61-62
• 结论62
• 论文创新点62-63
• 不足之处63-64
• 参考文献64-74
• 发表论文和参加科研情况说明74-76
• 综述 α-氨基-3 羟基5甲基4异恶唑丙酸受体在瑞芬太尼痛觉过敏中的作用的研究进展76-85
• 综述参考文献82-85
• 致谢85-86
• 个人简历86

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前8条

1 王志芬;王国林;敖吉莹;丁玲;李楠;汤晓红;张麟临;舒瑞辰;元元;;PICK1在瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓含GluR1及GluR2亚基的AMPA受体转运中的作用[J];中华麻醉学杂志;2015年08期

2 闫丽萍;侯保权;吴辛甜;王玲玲;马骋;;电针对坐骨神经慢性缩窄损伤大鼠脊髓α-氨基-3-羧基-5-甲基异恶唑-4-丙酸受体表达的影响[J];针刺研究;2014年05期

3 王苗苗;王超;杨美华;王国林;;α-氨基-3羟基-5-甲基-4-异恶唑丙酸受体运输参与学习记忆机制的研究进展[J];国际麻醉学与复苏杂志;2014年06期

4 ;AMPA receptor trafficking in inflammation-induced dorsal horn central sensitization[J];Neuroscience Bulletin;2012年02期

5 马剑锋;黄志莲;李军;胡社军;连庆泉;;瑞芬太尼致术后患者痛觉过敏的队列研究[J];中华医学杂志;2011年14期

6 吴晓丽;马正良;顾小萍;崔松勤;;氯胺酮预防瑞芬太尼痛觉过敏的实验研究[J];国际麻醉学与复苏杂志;2010年02期

7 王佩;王海祥;王维平;;突触可塑性与学习记忆[J];脑与神经疾病杂志;2008年05期

8 李依泽;王超;汤晓红;王春艳;谢克亮;王海云;于泳浩;王国林;;切口痛-瑞芬太尼痛觉过敏大鼠脊髓背角含GluR1和GluR2亚基AMPA受体表达的变化[J];中华麻醉学杂志;2013年07期

  本文关键词：蛋白激酶Cα相互作用蛋白1调控AMPA受体在瑞芬太尼痛觉过敏中的机制研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：510255