内质网应激在X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良发病机制中的作用

发布时间：2017-07-21 04:25

  本文关键词：内质网应激在X-连锁迟发性脊柱骨骺发育不良发病机制中的作用

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【摘要】：目的:采用慢病毒介导的LV-siSEDL沉默人软骨细胞(HC-a)中SEDL基因的表达,观察SEDT细胞模型中是否有内质网应激(ERS)的产生及其信号通路激活情况,初步探索ERS在SEDT发病机制中的作用。方法:实验分为3组:空白对照组(加PBS的HC-a)、LV-组(转染空载慢病毒的HC-a)、LV组(转染干扰慢病毒LV-siSEDL的HC-a)。(1)不同浓度(0-10ug/ml)的嘌呤霉素(Puro)作用于人软骨细胞(HC-a)12h、24h、48h、72h和96h,采用最小抗生素浓度的Puro筛选转染慢病毒的细胞株。(2)QPCR、Western Blot分别检测SEDL mRNA、Sedlin蛋白表达水平,确定SEDT细胞模型是否建立成功。(3)QPCR检测ERS信号通路上相关应激信号分子mRNA表达水平,观察基因水平上是否有ERS产生及信号通路随时间的激活情况。(4)根据QPCR的结果,采用Western Blot从蛋白水平上验证是否有ERS产生及信号通路随时间的激活情况。(5)采用Annexin-FITC/PI双染法检测HC-a的凋亡率。结果:(1)确定puro72h杀死所有hc-a的最小抗生素浓度为5ug/ml。(2)病毒转染4天,lv组sedlmrna及sedlin蛋白相对表达量分别为(0.27±0.02)、(0.05±0.01),与lv-组及空白对照组相比显著下调(p0.001),成功构建了sedt细胞模型。(3)病毒转染4天,lv组各应激信号分子mrna相对表达量与lv-组及空白对照组相比,差异无统计学意义(p0.05);病毒转染5天,lv组xbp-1、atf-6mrna相对表达量分别为(2.25±0.17)、(1.40±0.08),与lv-组及空白对照组相比明显上调(p0.05);病毒转染6天,lv组grp78、atf-4、chopmrna相对表达量分别为(1.75±0.16)、(1.82±0.14)和(2.73±0.21),与lv-组及空白对照组相比显著上调(p0.01)。而lv组nfkbia、nfkb-1及relamrna相对表达量与lv-组及空白对照组相比,差异无统计学意义(p0.05)。(4)病毒转染4天,lv组grp78蛋白相对表达量为(3.09±0.09),与lv-组及空白对照组相比明显上调(p0.001),随后逐渐下降;病毒转染6天,lv组atf-4蛋白相对表达量为(0.61±0.03),与lv-组及空白对照组相比显著上调(p0.001);而chop蛋白相对表达量随着病毒转染时间的延长逐渐上调,且lv组chop蛋白相对表达量与lv-组及空白对照组相比,差异均有统计学意义(p0.01)。(5)病毒转染6天,与lv-组(4.60±0.23)%及空白对照组(3.89±0.15)%相比,lv组凋亡率(9.78±0.56)%显著上调(p0.05)。结论:初步证实SEDT细胞模型中有内质网应激(ERS)的发生,而且是通过激活未折叠蛋白反应(UPR)中的PERK/eIF2α/ATF-4信号通路,最终诱导HC-a凋亡在SEDT的发病机制中发挥作用。
【关键词】：SEDL Sedlin 软骨细胞 内质网应激
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R726.8
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 前言12-13
• 1 材料13-18
• 2 方法18-26
• 3 结果26-36
• 4 讨论36-39
• 5 结论39-40
• 全文总结40-41
• 参考文献41-43
• 文献综述43-54
• 参考文献50-54
• 致谢54-55
• 攻读硕士学位期间发表的论文55

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本文编号：571457