NOV的差异表达对人骨肉瘤细胞系增殖、凋亡和迁移的影响及机制研究

发布时间：2017-07-21 05:07

  本文关键词：NOV的差异表达对人骨肉瘤细胞系增殖、凋亡和迁移的影响及机制研究

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【摘要】：目的检测人骨肉瘤细胞系中肾母细胞瘤过表达(nephroblastoma overexpressed,NOV)基因的表达水平;采用腺病毒介导的基因过表达或干扰技术探讨NOV对人骨肉瘤细胞株143B和MG63增殖、凋亡和迁移等作用的影响,并对其作用的分子机制进行初步研究。方法1.人骨肉瘤细胞系中NOV的表达水平检测:以本实验室保存的4种人骨肉瘤细胞株(143B、U2OS、MG63和SaOS2)为研究对象,分别采用半定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白质印迹(Western blot)检测各细胞中NOV的表达水平,从而确定不同类型人骨肉瘤细胞的差异表达。2.重组腺病毒的感染效率验证:携带人NOV过表达基因的重组腺病毒Ad-NOV及其空载体阴性对照Ad-GFP和表达针对人NOV的siRNA的重组腺病毒Ad-siNOV及其阴性对照Ad-RFP分别用于感染对应的低表达和高表达NOV的人骨肉瘤细胞株,荧光显微镜下观察病毒感染效率,并通过RT-PCR和Western blot验证NOV在mRNA和蛋白水平的表达或干扰效果。3.nov的差异表达对人骨肉瘤143b和mg63细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响:143b和mg63细胞经病毒处理相应时间后,采用mtt法、克隆形成实验和流式细胞术(fcm)检测细胞增殖能力的改变;hochest33258染色和fcm用于检测细胞的凋亡水平;通过划痕实验和transwell小室法检测对细胞迁移及侵袭能力的影响。此外,进一步采用rt-pcr和westernblot检测细胞中凋亡相关蛋白bcl-2和bax以及与迁移密切相关的基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase,mmp)家族的表达变化,以反映细胞的凋亡和迁移能力改变。4.nov的差异表达对人骨肉瘤143b和mg63细胞中信号通路的影响:病毒处理143b和mg63细胞48h后,采用rt-pcr和westernblot检测整合素受体家族的表达;荧光素酶报告质粒检测异常活化的信号分子,westernblot检测pi3k/akt、mapk及下游ap-1等相关蛋白的磷酸化水平,从而明确nov作用于人骨肉瘤细胞的信号通路。5.mapk信号通路在nov诱导的骨肉瘤143b细胞增殖、凋亡和迁移中的作用:应用mapk/p38的抑制剂sb203580和mapk/jnk的抑制剂sp600125分别处理143b细胞,westernblot检测p-p38和p-jnk的表达水平,验证抑制剂的效率;细胞经抑制剂处理相应时间后,采用mtt法检测细胞活力,transwell小室法检测细胞迁移能力的变化,并通过westernblot检测细胞中凋亡相关蛋白bcl-2和bax表达的改变。结果1.4株骨肉瘤细胞株经rt-pcr检测后结果显示,nov的表达存在明显的差异,其中在143b细胞中的表达水平最低,在saos2和u2os细胞中有一定程度的表达,而在mg63细胞中表达水平为最高。westernblot结果得到的nov蛋白表达水平与mrna结论基本一致。2.143b和mg63细胞经相对应的腺病毒感染24-36h后,荧光显微镜下可见细胞中绿色和红色荧光蛋白表达有所增强,镜下判断腺病毒在细胞中的感染效率达到60-70%。rt-pcr和westernblot结果显示143b细胞中ad-nov组的nov的表达明显高于ad-gfp组(p0.01)和空白对照组(p0.05);mg63细胞中ad-sinov组的nov灰度值则显著低于ad-rfp组和空白对照组(p0.05)。结果提示nov在mrna和蛋白水平均被成功过表达或干扰。3.增殖能力相关检测结果显示,143b细胞中ad-nov组的细胞增殖能力在48h受到了抑制(p0.05),并且该抑制作用在72h表现的更为显著(p0.01);克隆形成实验结果亦有类似的发现,ad-nov组的细胞克隆形成能力比对照组降低了23%(p0.01);fcm结果证实nov的过表达导致了143b细胞的周期阻滞。与之相反,在mg63细胞中,一系列实验结果显示ad-sinov组中细胞的增殖能力(p0.01),克隆形成能力(p0.05)都有所增强,对于细胞周期也有一定程度的促进。凋亡水平相关检测结果显示,143b细胞经ad-nov处理48h后发生早期凋亡的细胞所占比例显著高于ad-gfp对照组(p0.01),细胞核染色质经hochest33258染色也表现出明显的聚集现象。同时,rt-pcr和westernblot结果显示ad-nov组细胞促凋亡因子bax表达上调(p0.01),抗凋亡因子bcl-2表达下降(p0.05)。反之在mg63细胞中,经ad-sinov处理后发生凋亡的细胞数目减少(p0.05),细胞核染色质的聚集程度减弱,bax和bcl-2的表达水平也表现出与143b细胞中相反的现象。划痕实验和transwell分析显示,ad-nov感染后的143b细胞迁移能力明显增强,细胞的穿膜数目相对于对照组有所上升;rt-rcr结果进一步显示迁移促进因子mmp蛋白家族的表达在ad-nov组细胞中增强。而ad-sinov感染后mg63细胞的表现与上述内容恰恰相反。4.rt-pcr和westernblot结果显示,在ad-nov感染的143b细胞中,整合素受体αv和β3的mrna和蛋白表达水平都有上调;荧光素酶报告基因检测结果提示细胞中ap-1和nf-κb信号分子异常活化。此外,p38和jnk的磷酸化水平在ad-nov组细胞中均有明显上调,而p-akt则无改变。在ad-sinov感染的mg63细胞中,无论是整合素受体还是信号分子的磷酸化水平都表现为下降趋势。5.使用mapk/p38的抑制剂sb203580和mapk/jnk的抑制剂sp600125分别处理143b细胞后,westernblot结果显示细胞中p-p38和p-jnk的表达水平相比ad-nov组均有下调,提示sb203580和sp600125有效抑制了143b细胞中由于nov过表达而激活的mapk/p38和mapk/jnk信号通路。mtt结果显示经抑制剂作用后的143b细胞增殖能力减弱,低于未经抑制剂作用的ad-nov组;transwell分析提示sb203580和sp600125能够部分抑制nov过表达诱导的细胞迁移。westernblot结果显示使用抑制剂后,ad-nov组细胞中bax表达的上调趋势被削弱,而bcl-2的表达则有所恢复,进一步证实细胞凋亡水平被抑制。结论1.4种人骨肉瘤细胞株中NOV的表达水平存在明显的差异。2.NOV的过表达能够抑制人骨肉瘤细胞的增殖能力,而在一定程度上促进细胞的凋亡和迁移。3.NOV能够上调人骨肉瘤细胞表面的整合素受体表达,进而激活MAPK/p38和MAPK/JNK信号通路,但对PI3K/Akt通路无明显影响。4.骨肉瘤细胞中MAPK/p38和MAPK/JNK信号通路的活化参与调控NOV对该细胞的增殖、凋亡和迁移作用。
【关键词】：NOV 骨肉瘤 整合素受体 p38/JNK信号通路
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R738.1
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照4-6
• 中文摘要6-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-18
• 第一部分 NOV在人骨肉瘤细胞系中的表达水平18-25
• 1 材料与方法18-23
• 2 结果23-24
• 3 讨论24-25
• 第二部分 NOV对人骨肉瘤细胞系增殖、凋亡和迁移的影响25-35
• 1 材料与方法25-28
• 2 结果28-33
• 3 讨论33-35
• 第三部分 NOV作用于人骨肉瘤细胞系的机制研究35-43
• 1 材料与方法35-36
• 2 结果36-41
• 3 讨论41-43
• 全文总结43-44
• 参考文献44-47
• 文献综述47-55
• 参考文献51-55
• 致谢55-56
• 攻读硕士期间发表的论文56

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