MANF参与缺氧预处理减轻大鼠创伤性颅脑损伤后内质网应激的实验研究

发布时间：2017-08-06 18:20

  本文关键词：MANF参与缺氧预处理减轻大鼠创伤性颅脑损伤后内质网应激的实验研究

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【摘要】：在目前常规武器战争中,参战人员会身负的大量战伤,颅脑损伤为战争时及战后最致命性的损伤。创伤性颅脑损伤(TBI)后有多种继发性损害,其中尤以细胞凋亡为特征的一些改变将会显著影响病情的转归。内质网应激反应/敏感蛋白MANF(mesencephalic astrocyte-derived neurotrophic factor)能够增强细胞对多种不利因素如无糖状态以及其它内质网应激诱因等的耐受性,通过调控内质网应激感受器的活性来改善细胞生理状态,从而减少细胞凋亡。研究MANF在创伤性颅脑损伤后的动态表达变化以及其干预措施也许会成为改善创伤性颅脑损伤预后的新的临床切入点。第一部分MANF在大鼠创伤性颅脑损伤后皮质表达变化的实验研究目的研究MANF在创伤性颅脑损伤大鼠脑皮质的动态表达变化;探究MANF在颅脑损伤后细胞凋亡病理过程中的作用;方法108只Sprague-Dawley雄性大鼠,体质量:230~280g,由安徽医科大学动物实验中心提供,按照随机数字表法分为颅脑损伤TBI组(n=96)和对照Con组(n=12),TBI组采用Feeney’s自由落体撞击法构建模型,对照组不予处理。于伤后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d、14d八个不同时间点处死大鼠,选取大鼠挫伤区周围皮质脑组织,采用RT-q PCR、和Western blot检测不同时间点选取的标本组织中MANF m RNA及其蛋白的动态表达变化;采用免疫组化染色检测MANF在挫伤区周围皮层脑组织中的分布并测定其累积光密度值;结果rt-PCR结果:皮质中MANF m RNA表达量在TBI后1h升高,6h达到高峰值,随即开始下降,14d时表达回归至正常水平,除14d外各时间点TBI组表达均高于Con组,差异具有统计学意义(P0.05),MANF免疫组化染色结果提示其蛋白阳性表达呈棕褐色或棕黄色,定位在胞质,TBI后1h胞质中即出现棕褐色或棕黄色颗粒,6h最明显,之后各时间点胞质颜色逐渐淡染,14d时切片与Con组无差异。Western-blot及免疫组化法检测的MANF蛋白结果:TBI后1h开始升高,6h达到高峰值,14d时表达回归至正常水平,除14d外各时间点TBI组表达均高于Con组,差异具有统计学意义(P0.05);结论颅脑损伤后MANF阳性表达定位在胞质;MANF m RNA及其蛋白升高可能与细胞在颅脑损伤时激活一种内源性神经保护机制有关,MANF可能参与减少颅脑损伤后内质网应激途径介导的细胞凋亡。第二部分MANF参与缺氧预处理减轻大鼠创伤性颅脑损伤后内质网应激的实验研究第一节:缺氧预处理对大鼠创伤性颅脑损伤后内质网应激的影响目的探讨缺氧预处理(HPC)对创伤性颅脑损伤(TBI)大鼠脑皮质促凋亡蛋白C/EBP同源蛋白(CHOP)表达、神经元凋亡及神经功能的影响。方法健康SD雄性大鼠48只按随机数字表法分为HPC组(给予HPC模型制作)和未HPC组(不予HPC预处理),每组24只;然后进一步分别按随机数字表法分为对照组(不做任何处理)及TBI后1 d、3 d、7 d组(给予TBI模型制作,按照TBI后不同时间点观察、处死并取材),每组6只。再另取SD大鼠48只,按上述方式分组,用于进行m NSS评分及灌注后取脑用,大鼠在低压氧仓中进行每天3 h、连续3 d训练以给予HPC,采用改良的Freeny’s法制作TBI模型。对各组大鼠进行神经功能严重程度评分(m NSS),q RT-PCR及Western blotting检测挫伤区周围皮质CHOP m RNA及蛋白表达,TUNEL法检测神经元凋亡情况,统计学方法分析CHOP表达水平与神经元凋亡指数的相关性。结果TBI 1 d、3 d、7 d组大鼠m NSS评分、CHOP m RNA和蛋白相对表达量、神经细胞凋亡指数较对照组均明显增高,并在伤后3 d时达到高峰值,差异均有统计学意义(P0.05);并且,HPC组m NSS评分、CHOP m RNA和蛋白相对表达量、神经细胞凋亡指数均显著低于未HPC组,差异均有统计学意义(P0.05)。HPC组和未HPC组中TBI 1 d、3 d、7 d组CHOP表达与神经细胞凋亡指数呈正相关(Pearson系数分别为0.957、0.966)。结论HPC通过下调ERS途径中CHOP的表达以减少神经元凋亡,从而改善神经功能。第二节:缺氧预处理对创伤性颅脑损伤大鼠MANF表达的影响目的通过观察缺氧预处理对大鼠创伤性颅脑损伤后挫伤区周围MANF和CHOP的动态表达变化的影响,探究MANF参与缺氧预处理减轻大鼠颅脑损伤后内质网应激的机制。方法108只Sprague-Dawley雄性大鼠,按照随机数字表法分为缺氧预处理组和未进行缺氧预处理组,每组54只,然后进一步按随机数字表法分为对照组及TBI后1h、3h、6h、12h、24h、3d、7d、14d组(TBI模型制作完成后于对应的时间点处死大鼠),每亚组各6只。缺氧预处理组大鼠在低压氧仓(-50k Pa)中进行连续3天、每天持续3小时进行造模;TBI造模方法同第一部分,HPC结束后1d行TBI打击,造模结束后各亚组中大鼠直接处死,留取脑组织保存于液氮罐中用于行rt-PCR及Western-blot检测。结果MANF m RNA及其蛋白在颅脑损伤后1h就开始上调,伤后6h达到高峰值,之后开始下降,伤后7d时仍高于对照组,伤后14d时回归到正常水平,相邻亚组间比较差异均有统计学意义(P0.05);CHOP m RNA及其蛋白在伤后1h就开始增高,伤后3d才达高峰值,之后开始下降,到伤后7d时表达仍高于对照组,伤后14d时回归到正常水平,相邻亚组间比较差异均有统计学意义(P0.05)。HPC组大鼠伤后1h-7d各时间点MANF m RNA及其蛋白相对表达量均高于未HPC组,HPC组大鼠伤后1h-7d各时间点CHOP m RNA及其蛋白相对表达量均低于未HPC组(均P0.05)。对照组间比较:Con组与HPC组间比较差异无统计学意义(P0.05)。结论缺氧预处理可使MANF表达增多,减少内质网应激途径中CHOP表达,减少神经细胞凋亡。
【关键词】：创伤性颅脑损伤 MANF 缺氧预处理 CHOP 内质网应激
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.15
【目录】：

• 英汉缩略语名词对照表6-7
• 中文摘要7-11
• Abstract11-16
• 前言16-18
• 第一部分MANF在大鼠创伤性颅脑损伤后皮质表达变化的实验研究18-35
• 1.材料与方法18-29
• 2.实验结果29-32
• 3.讨论32-34
• 4.结论34-35
• 第二部分MANF参与缺氧预处理减轻大鼠创伤性颅脑损伤后内质网应激的实验研究35-50
• 第一节：缺氧预处理对大鼠创伤性颅脑损伤后内质网应激的影响35-45
• 1.材料与方法35-40
• 2.结果40-43
• 3.讨论43-45
• 第二节：缺氧预处理对创伤性颅脑损伤大鼠MANF表达的影响45-50
• 1.材料与方法45
• 2.结果45-47
• 3.讨论47-49
• 4.结论49-50
• 全文总结50-51
• 参考文献51-54
• 附录54-55
• 致谢55-56
• 综述56-62
• 参考文献61-62

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本文编号：630945