吗啡预处理通过调控miR-133b-5p减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤的作用及机制

发布时间：2017-08-14 14:11

  本文关键词：吗啡预处理通过调控miR-133b-5p减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤的作用及机制

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【摘要】：背景micro RNAs(mi RNAs)是一类新型非编码小RNA,在转录后水平调节靶基因的表达,参与各种病理生理过程。已报道mi RNA可以参与调节心肌细胞凋亡、心肌梗死、心肌重塑、心肌缺血再灌注损伤、药物预处理等过程。本课题组前期利用mi RNA芯片技术发现mi R-133b-5p在心力衰竭大鼠心肌细胞中表达量明显降低,而经历吗啡预处理(morphine preconditioning,MPC)后,mi R-133b-5p水平显著升高。本课题拟在前期研究基础上,进一步研究mi R-133b-5p介导MPC心肌细胞保护效应的作用及机制。方法1.mi R-133b-5p inhibitor转染效率验证。对数期生长的H9c2心肌细胞长至40-50%细胞融合度时转染mi R-133b-5p inhibitor(FAM标记),48 h后荧光显微镜下观察绿色荧光标记的细胞占总细胞的比例,q RT-PCR验证细胞内mi R-133b-5p下降水平。2.mi R-133b-5p在心肌细胞凋亡中的作用及其机制。对数期生长的H9c2心肌细胞随机分为3组:正常对照组(CON)、抑制剂组(mi R-133b-5p inhibitor)、抑制剂对照组(inhibitor-NC)。CON正常培养,mi R-133b-5p inhibitor在细胞长至40-50%融合度时转染mi R-133b-5p inhibitor,inhibitor-NC在细胞长至40-50%融合度时转染mi R-133b-5p inhibitor-NC。48 h后收集培养液上清检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性,收集细胞利用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡率,最后利用q RT-PCR和Western Blot检测各组凋亡相关分子Fas的表达情况。3.mi R-133b-5p在吗啡预处理减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤中的作用及其机制。对数期生长的H9c2心肌细胞随机分为5组:正常对照组(CON)、缺氧再给氧组(hypoxia/reoxygenation,H/R)、吗啡预处理组(MPC)、吗啡预处理+抑制剂组(MPC+mi R-133b-5p inhibitor)、吗啡预处理+抑制剂对照组(MPC+inhibitor-NC)。CON细胞正常培养。H/R细胞给予缺氧5h、复氧1h处理。MPC细胞在H/R之前给予1mmol/L吗啡预处理10 min。MPC+mi R-133b-5p inhibitor细胞在吗啡预处理前24 h转染mi R-133b-5p inhibitor。MPC+inhibitor-NC细胞在吗啡预处理前24 h转染mi R-133b-5p inhibitor。吸取各组细胞培养液上清检测LDH活性,细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8,CCK-8)检测心肌细胞活力,流式细胞仪检测细胞凋亡率,最后利用q RT-PCR和Western Blot检测各组凋亡相关分子Fas的表达情况。结果1.mi R-133b-5p inhibitor转染效率验证。H9c2心肌细胞转染mi R-133b-5p inhibitor(FAM标记)48后,荧光显微镜下观察发现大于80%的细胞带有绿色荧光标记,q RT-PCR检测发现细胞转染mi R-133b-5p inhibitor后mi R-133b-5p表达水平明显降低,即转染效率满意。2.mi R-133b-5p在心肌细胞凋亡中的作用及其机制。与CON组相比,mi R-133b-5p inhibitor组细胞mi R-133b-5p表达明显下降,培养液LDH活性增多,细胞凋亡率升高(P0.05),而inhibitor-NC组细胞mi R-133b-5p表达、LDH活性、细胞凋亡率变化均无统计学意义。与CON组相比,mi R-133b-5p inhibitor组细胞Fas m RNA与Fas蛋白表达增加(P0.05),而inhibitor-NC组Fas表达无明显变化。3.mi R-133b-5p在吗啡预处理减轻心肌细胞缺氧再给氧损伤中的作用及其机制。与CON相比,H/R、MPC MPC+mi R-133b-5p inhibitor和MPC+inhibitor-NC组细胞活力下降,LDH水平增加,凋亡率增加,mi R-133b-5p表达下调(P0.05)。与H/R组相比,MPC组mi R-133b-5p表达明显上调,细胞活力增加,LDH水平减少,细胞凋亡率减少,Fas表达下调(P0.05)。与MPC组相比,MPC+mi R-133b-5p inhibitor组mi R-133b-5p表达明显下调,细胞活力降低,LDH水平增加,细胞凋亡率增加,Fas表达上调(P0.05),而MPC+inhibitor-NC组mi R-133b-5p表达、细胞活力、LDH水平、细胞凋亡率、Fas表达变化均无统计学意义。结论吗啡预处理可能通过上调mi R-133b-5p,进一步抑制靶基因Fas m RNA和蛋白表达水平,从而减轻心肌细胞缺血再灌注缺氧再给氧损伤。
【关键词】：心肌细胞 微小 RNAs 凋亡 缺氧再给氧损伤 吗啡预处理
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R614
【目录】：

• 英文缩略词表5-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-12
• 1.引言12-14
• 2. 材料与方法14-31
• 3. 结果31-44
• 4. 讨论44-47
• 5. 结论47-48
• 6. 参考文献48-51
• 附录51-53
• 致谢53-54
• 综述54-66
• 参考文献63-66

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本文编号：673052