生物电纺技术的研发及组织工程骨的构建

发布时间：2017-08-30 11:45

  本文关键词：生物电纺技术的研发及组织工程骨的构建

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【摘要】：实验一骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨分化能力的研究目的:体外获取人骨髓间充质干细胞、纯化、扩增,同时探讨其生物学特性及成骨分化能力。方法:全骨髓贴壁法体外分离培养人骨髓间充质干细胞,观察其增殖、生长特性和组织学形态;流式细胞术检测第4代细胞表面抗原CD44、CD90、CD105、CD73、CD34、CD45、HLA-DR的表达情况;向成骨细胞诱导分化,分别采用茜素红染色、碱性磷酸酶染色及Ⅰ型胶免疫细胞化学染色鉴定其分化成骨的能力。结果:贴壁的骨髓间充质干细胞为纺锤形,呈克隆样生长,性状稳定,具有较强的增殖能力。流式细胞术检测第4代细胞高表达CD44、CD90、CD105、CD73,不表达CD34、CD45、HLA-DR。经成骨诱导培养后,茜素红染色、碱性磷酸酶染色、Ⅰ型胶原免疫细胞化学染色均呈阳性。结论:人骨髓间充质干细胞分离提取操作简便易行,且有较强的生长增殖能力,在成骨诱导培养基作用下的人骨髓间充质干细胞可以向成骨细胞分化,并能够稳定表达成骨细胞特异表型。实验二人骨髓间充质干细胞复合P3HB4HB/PVA纳米仿生纤维体内异位成骨能力的研究目的:探讨人骨髓间充质干细胞复合P3HB4HB/PVA纳米仿生三维支架体外成骨诱导后植入裸鼠体内异位构建组织工程化骨的能力。方法:利用同轴电纺技术制作P3HB4HB/PVA纳米仿生三维支架,取第4代人骨髓间充质干细胞以2×107/ml的密度接种在纳米仿生三维支架上,分诱导组和未诱导组。扫描电镜和透射电镜观察三维支架的微观结构,接触角测定材料的亲水性,荧光染色和DAPI染色观察细胞在三维支架上的生长情况。诱导组细胞-支架复合物在成骨诱导培养基中体外培养2周后植入裸鼠背部皮下,未诱导组细胞-支架复合物在完全培养基中体外培养2周后植入裸鼠背部皮下。观察细胞-支架复合物在裸鼠皮下的形态变化。分别于8周和16周取材行HE染色、茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色。结果:同轴电纺制备的纳米仿生三维支架表现出良好的亲水性和细胞吸附性。扫描电镜见纳米纤维连续、均一,细胞在纤维上粘附、生长。透射电镜可见纳米纤维的芯壳结构。测量得同轴电纺的P3HB4HB/PVA复合纤维膜接触角小于单纯的P3HB4HB纤维膜,亲水性更佳,差异具有统计学意义(P0.05)。荧光染色和DAPI染色结果显示细胞可在支架上粘附、增殖。细胞-支架复合物植入裸鼠体内,裸鼠生存状态良好,诱导组复合物大小形态基本保持原状,质地变硬;未诱导组逐渐缩小至完全降解。8周和16周时诱导组HE染色、茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色检测均呈阳性。未诱导组均呈阴性。结论:人骨髓间充质干细胞复合P3HB4HB/PVA纳米仿生三维支架经体外成骨诱导后,初步具有在裸鼠体内异位构建组织工程化骨的能力,但支架材料的降解需要进一步调控。实验三生物电纺P3HB4HB/PVA-h BMSCs复合物体内异位成骨能力的研究目的:利用同轴电纺技术,一次成型细胞-支架复合物。探讨P3HB4HB/PVA-h BMSCs复合物在体内构建组织工程化骨的能力。方法:采用同轴电纺技术制备出芯为P3HB4HB,壳为PVA与人骨髓间充质干细胞混合液的一次成型复合物,分诱导组和未诱导组。扫描电镜、荧光染色、DAPI染色观察复合物微观结构及细胞黏附、增殖情况。诱导组细胞-支架复合物在成骨诱导培养基中体外培养2周后植入裸鼠背部皮下,未诱导组细胞-支架复合物在完全培养基中体外培养2周后植入裸鼠背部皮下。观察细胞-支架复合物在裸鼠皮下的形态变化。分别于8周和16周取材行HE染色、茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色。结果:扫描电镜见细胞在纤维上粘附和生长,并分泌大量基质。荧光染色和DAPI染色结果均显示细胞大量、均匀的种植在支架上。细胞-支架复合物植入裸鼠体内,裸鼠生存状态良好,诱导组复合物大小形态基本保持原状,质地变硬;未诱导组逐渐缩小至完全降解。8周和16周时诱导组HE染色、茜素红染色、Von Kossa染色、马松三色染色、Ⅰ型胶原免疫组化染色检测均呈阳性。未诱导组均呈阴性。结论:同轴电纺一次成型构建的P3HB4HB/PVA-h BMSCs复合物,经体外成骨诱导后初步具有在裸鼠体内异位构建组织工程化骨的能力。
【关键词】：骨髓间充质干细胞 细胞培养 成骨诱导 同轴电纺 生物电纺 P3HB4HB 组织工程 异位成骨
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R318.08;R68
【目录】：

• 中文摘要4-6
• 英文摘要6-11
• 略缩词表11-12
• 引言12-15
• 实验一 骨髓间充质干细胞的分离培养及成骨分化能力的研究15-22
• 材料与方法15-18
• 结果18-19
• 讨论19-20
• 附图20-22
• 实验二 人骨髓间充质干细胞复合P3HB4HB/PVA纳米仿生纤维体内异位成骨能力的研究22-35
• 材料与方法22-25
• 结果25-27
• 讨论27-30
• 附图30-35
• 实验三 生物电纺P3HB4HB/PVA-hBMSCs复合物体内异位成骨能力的研究35-47
• 材料与方法35-37
• 结果37-39
• 讨论39-43
• 附图43-47
• 结论47-48
• 参考文献48-52
• 综述52-63
• 参考文献59-63
• 作者简历63-65
• 致谢65-66
• 学位论文数据集66

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本文编号：759131