自体富血小板血浆对兔膝关节软骨Ⅱ度损伤修复作用研究

发布时间：2017-09-10 04:51

  本文关键词：自体富血小板血浆对兔膝关节软骨Ⅱ度损伤修复作用研究

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【摘要】：[目的]软骨损伤在关节外科疾病中较为常见,未经有效治疗的关节软骨损伤大多发展为骨性关节炎,后期出现关节生物力学改变、严重疼痛甚至畸形,导致功能障碍,加重患者心理或精神负担。药物保守治疗及软骨移植或关节镜下微骨折钻孔减压等传统的治疗方法均未取得满意效果。近年来,随着对自体富血小板血浆(platelet-rich plasma, PRP)作用机制研究领域的逐渐深入,自体富血小板血浆在骨科软骨损伤修复中也取得了一定的疗效。因其含有大量各种生长因子对软骨细胞增殖和细胞外基质合成具有促进作用,成为了研究热点。但国内外对于自体富血小板血浆在关节软骨Ⅱ度损伤中的研究甚少。本实验通过兔自体富血小板血浆对膝关节软骨Ⅱ度损伤模型中软骨修复程度的变化,来比较不同分组之间术后膝关节软骨修复程度的区别,为临床提供理论依据与指导意见。[方法]1.分组：选取36只健康新西兰大白兔作为实验对象,随机分为PRP组、透明质酸钠组(hyaluronic acid, HA)和生理盐水组(normal saline, NS),每组12只。三组实验动物均于手术后12周处死；2.采血：用含有肝素钠抗凝剂的真空采血管对每只实验动物行耳中央动脉采血8ml,另外用含EDTA-K2抗凝剂的真空采血管采血2ml；3.离心：应用二次离心法制备PRP,配平后进行第一次离心,转速2000r/min,时间10min,离心后用注射器吸取交界层以下2mm的红细胞并弃去,剩余部分放入离心机中配平后进行第二次离心,转速2000r/min,时间10min,离心后用注射器吸取血清层的上方3/4部分并弃去,剩余部分即为PRP。8ml兔动脉血可制备约0.8mlPRP;4.血小板计数：将采血时得到的EDTA-K2抗凝的2ml血液以及制成的PRP放入血细胞分析仪中进行血小板计数；5.软骨损伤造模及干预：每只实验动物均采用膝前正中切口切开膝关节前方皮肤后以髌旁内侧入路切开膝关节囊,充分暴露兔膝关节内侧髁后用克氏针束在其内侧髁正中部位制造Ⅱ度的软骨损伤模型(面积约2×3mm2、深度约0.3mmm),然后,PRP组向左膝关节腔内注入之前制备的0.8ml PRP及50ul激活剂(葡萄糖酸钙、牛凝血酶),HA组向左膝关节腔内注入0.8ml透明质酸钠,NS组左膝注入0.8ml生理盐水。术后实验动物均不予以制动；6.观察结果：空气栓塞法处死实验动物后,切开左膝关节囊暴露软骨损伤部位进行大体观察,并应用国际软骨修复协会(International Cartilage Repair Society, ICRS)对其进行大体评分,之后对损伤修复部位进行取材制成组织切片并行HE染色、番红-O染色及免疫组织化学染色,对其进行显微镜下观察并应用奥德里斯科尔组织学评分(O' Driscoll histological score)对其进行评价。对于免疫组织化学染色结果运用IPP(Image-Pro Plus, IPP)6.0图像分析软件对Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学染色的平均光密度值进行测量。[结果]在术后12周时组与组之间可见显著差异,RPP组损伤区域表面修复较好,表面较平滑、光整；HA组仍可见损伤痕迹；NS组损伤区域修复较差,表面粗糙、凹凸不平。HE染色可见PRP组新生组织与正常软骨组织从细胞形态、细胞分布及细胞外基质分布方面都相似,软骨细胞增生较多；HA组新生软骨细胞量较PRP组少；NS组新生软骨细胞量最少,新生组织与正常软骨组织从细胞形态、细胞分布及细胞外基质分布方面有明显差异。番红-O染色也可见PRP组损伤区域和周围正常区域相似；HA组有大量番红-O着色的软骨基质,软骨细胞增殖旺盛；NS组的软骨细胞增生量相对较少,且多为成纤维细胞。免疫组织化学染色见PRP组损伤区域有大量的Ⅱ型胶原蛋白,损伤修复区域与正常组织之间未见明显区分；HA组免疫组织化学染色切片观察见软骨损伤区域表面缺乏Ⅱ型胶原蛋白,而软骨表层下可见少量Ⅱ型胶原蛋白；NS组免疫组织化学染色切片观察见损伤修复区域由少量Ⅱ型胶原蛋白和大量肉芽组织填充,见明显Ⅱ型胶原蛋白免疫组织化学淡染区,损伤修复区域与正常组织之间分界线比较明显。统计学分析,三组之间应用单因素方差分析(Analysis of variance, ANOVA),每两组之间进行比较应用LSD-t检验(least significant difference-t, LSD-t)。三组之间大体观察ANOVA结果显示：F=9.252,P=0.01(P0.05),每两组之间比较的LSD-t结果均为P0.05,差异均有统计学意义；三组之间HE染色和番红-O染色的显微镜下观察ANOVA结果显示：F=9.157,P=0.01(P0.05),每两组之间比较的LSD-t结果均为P0.05,差异均有统计学意义；三组之间免疫组织化学染色的平均光密度ANOVA结果显示：F=9.480,P=0.01(P0.05),每两组之间比较比较的LSD-t结果均为P0.05,差异均有统计学意义。[结论]通过本实验研究证实：1.PRP对软骨修复有着积极的促进作用,可促进关节软骨损伤后的修复速度,并且能刺激软骨细胞再生基质形成,使其恢复原有的组织形态与结构,提高软骨损伤的修复效果；2.PRP与HA对兔膝关节软骨损伤均有修复作用,但PRP对软骨的修复效果优于HA;3.PRP对兔膝关节软骨Ⅱ度损伤的修复效果较好,可为临床提供指导意见。
【关键词】：富血小板血浆 软骨修复 软骨细胞 软骨损伤 细胞增殖
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R684
【目录】：

• 缩略词表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-18
• 材料与方法18-25
• 结果25-28
• 附表28-32
• 附图32-47
• 讨论47-52
• 结论52-53
• 参考文献53-61
• 综述61-69
• 参考文献65-69
• 攻读学位期间获得的学术成果69-70
• 致谢70-71

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本文编号：824852