乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1受体的寻找与鉴定

发布时间：2017-09-23 03:53

  本文关键词：乳腺癌脑转移细胞系靶向肽BRBP1受体的寻找与鉴定

  更多相关文章： 受体 BRBP1-Fc肽体 免疫共沉淀 质谱

【摘要】：乳腺癌(Breast cancer)是女性最常见的恶性肿瘤,其发病率逐年提高,已成为严重威胁女性健康的重大疾病之一。脑转移是乳腺癌患者致死、致残的重要原因,大约10-30%的散发性患者会发生乳腺癌脑转移(breast cancer brain metastases, BCBM),用标准疗法(standard treatments),包括全脑放射治疗(whole brain radiotherapy, WBRT)、立体定向放射治疗(stereotactic radiosurgery, SRS)和手术(Surgery),平均中位生存期也只有1年。为此,研究乳腺癌脑转移的分子机制,阐明脑转移过程的相关靶标至关重要。我们实验室前期利用噬菌体展示肽库筛选技术(Phage display technology)对乳腺癌脑转移细胞系231-BR进行全细胞消减筛选,成功获得了与231-BR细胞系特异性结合的多肽BRBP1(专利号：ZL201210538671.4),体内外实验研究均已证实该肽与乳腺癌脑转移细胞系呈现出高亲和力结合,并且基于BRBP1肽构建的近红外荧光成像分子探针可用于脑转移性乳腺癌荷瘤鼠活体近红外荧光成像,构建的BRBP1-TAT-KLA复合肽可显著抑制乳腺癌脑转移灶的生成及生长。临床乳腺癌组织水平的初步研究也显示其与乳腺癌患者腋窝淋巴结转移手术切除标本特异性结合。因此,寻找与BRBP1肽特异结合的受体对深度认识BRBP1肽的功能、拓宽BRBP1肽的应用价值、探索乳腺癌脑转移机制具有重要意义。本研究课题主要内容包括以下：1.乳腺癌脑转移细胞系靶向肽体的表达与特异性鉴定利用基因重组技术构建pFUSE-hIgG2-Fc2-BRBP 1真核表达载体,表达BRBPl-Fc肽体,通过Western blotting实验验证蛋白表达正确,ELISA、流式细胞术以及竞争结合免疫荧光等实验证实BRBP1-Fc肽体保留BRBP1肽与231-BR细胞结合特性,为寻找BRBP1肽的受体以及进一步研究BRBP1的生物学功能奠定基础。2.免疫(共)沉淀方法对BRBP1肽特异性受体的寻找与鉴定目前寻找受体的方法有多种,但是并无普遍适用且保证成功的方法可遵循。本研究采用免疫(共)沉淀的方法寻找BRBP1肽的受体。即利用真核表达的BRBP1-Fc肽体和Protein G磁珠相互作用,合成BRBP1-BIOTIN生物素肽和链霉亲和素磁珠相互作用,通过免疫(共)沉淀的方法捕获与之相互作用的蛋白。实验设计严谨的对照,借助银染方法寻找差异性条带,通过串联质谱技术分析具体蛋白分子。差异表达蛋白共有24个,我们首先分析两次质谱结果共有的Annexin A2分子,通过细胞免疫荧光实验证实其在231-BR、MDA-MB-231、MCF-7细胞表面的表达情况符合期望受体分布,继而通过siRNA、免疫共沉淀实验研究Annexin A2是否和BRBP1肽相互作用。但是目前还没有明确二者的具体关系,仍有待后续进一步探究。此外,我们通过生物信息学软件分析得到3个候选受体分子(SND1、S100A8, AP2B1),需要后期实验证明。3.基于数据库生物信息学分析筛选BRBP1肽的受体Matthew D. Dun等研究者就乳腺癌脑转移细胞231-BR和乳腺癌亲代细胞MDA-MB-231细胞在protein、nmRNA、miRNA层面的差异做了综合、系统、全面、前沿的分析。Riesa M. B.等横向进行了乳腺癌脑转移细胞(231-BR)、肺转移细胞(LMD-231)、骨转移细胞(BMD-231)、肾上腺转移细胞(ADMD-231)以及乳腺癌亲代细胞(MD-231P)的基因芯片技术。通过检索相关数据库,我们共得到5个在231-BR细胞上调的膜分子,联合MCF-7细胞为对照,通过定量PCR技术初步筛选,发现相较于MDA-MB-231、MCF-7细胞,Moesin分子在231-BR细胞明显高表达。随后我们又通过Western blotting、细胞免疫荧光、流式细胞术实验证实Moesin分子表达情况符合期望受体分布。继而我们通过siRNA干扰实验研究Moesin分子和BRBP1肽相互作用情况。目前,我们已通过干扰实验初步确定二者的配受体关系。本研究的核心内容即为寻找靶向乳腺癌脑转移细胞系多肽BRBP1的受体。先后采用了免疫(共)沉淀-质谱分析、数据库筛查的方法。通过数据库筛查法所获得Moesin分子已初步证实和BRBP1肽的相互作用,通过质谱确立的候选分子需要后期进一步实验鉴定研究。
【关键词】：受体 BRBP1-Fc肽体 免疫共沉淀 质谱
【学位授予单位】：东南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9
【目录】：

• 中文摘要5-7
• 英文摘要7-11
• 主要英文缩写词表11-14
• 前言14-16
• 第一章 文献综述 乳腺癌脑转移发生机制及相关治疗的研究进展16-30
• 第二章 乳腺癌脑转移细胞系靶向肽体的表达与特异性鉴定30-43
• 1. 材料和试剂30-33
• 2. 实验方法33-38
• 3. 结果38-41
• 4. 讨论41-43
• 第三章 免疫(共)沉淀方法对BRBP1肽特异性受体的寻找与鉴定43-67
• 第一节 免疫(共)沉淀法寻找BRBP1肽特异性结合受体43-53
• 1. 材料和试剂43-45
• 2. 实验方法45-49
• 3. 结果49-51
• 4. 讨论51-53
• 第二节 质谱技术联合生物信息学分析候选受体53-58
• 1. 材料和试剂53
• 2. 实验方法53-54
• 3 结果54-57
• 4. 讨论57-58
• 第三节 BRBP1肽候选受体的验证58-67
• 1. 材料和试剂58-60
• 2. 实验方法60-62
• 3. 结果62-65
• 4 讨论65-67
• 第四章 基于数据库生物信息学分析筛选BRBP1肽的受体67-79
• 1. 材料和试剂67-68
• 2. 实验方法68-72
• 3. 结果72-76
• 4. 讨论76-79
• 小结与展望79-80
• References80-86
• 作者简介86
• 硕士期间发表论文86
• 硕士期间参加的会议86-87
• 致谢87

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本文编号：903019