大鼠脊髓损伤后PDXK与UCHL-1的表达变化及相互关系的研究

发布时间：2017-10-07 02:06

  本文关键词：大鼠脊髓损伤后PDXK与UCHL-1的表达变化及相互关系的研究

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【摘要】：目的探讨大鼠脊髓损伤(SCI)后,吡哆醛激酶(Pyridoxal Kinase,PDXK)和泛素羧基末端水解酶-1(ubiquitin-C-terminal hydrolase-L1,UCHL-1)的表达变化对大鼠后肢运动功能的影响及其相互之间的关系。方法采用Allen’s打击法制备大鼠脊髓损伤模型。成年SD雌性大鼠随机分为假手术(Sham)组,脊髓钝挫伤(SCI)12h、1d、5d、14d组。在脊髓损伤3d、7d和28d组,制备慢病毒介导的PDXK过表达(PDXK-ORF-LV)组。通过生物信息学预测分析PDXK和UCHL-1的相互关系。BBB评分观察脊髓损伤后大鼠后肢的运动功能;尼氏染色观察脊髓损伤后以及慢病毒介导的PDXK过表达后的脊髓灰质前角内组织的一般形态变化;免疫组织化学染色方法定位观察PDXK和UCHL-1在脊髓前角灰质的分布及其阳性细胞数的变化;WB定量检测PDXK和UCHL-1在脊髓损伤后蛋白相对含量变化;qRT-PCR定量检测脊髓损伤后PDXK的mRNA和UCHL-1的mRNA相对表达量的变化。结果BBB评分结果显示脊髓损伤后大鼠后肢运动功能立即消失处于完全瘫痪状态,脊髓损伤3d后有所恢复,直至第28d时BBB评分仍低于Sham组。尼氏染色显示脊髓损伤后大鼠脊髓前角运动神经元形态出现萎缩,神经元数量呈减少趋势。免疫组织化学方法结果显示PDXK免疫阳性产物定位于脊髓前角的神经元和神经胶质细胞的胞浆,少量表达于细胞核内;UCHL-1免疫阳性产物主要定位于脊髓前角的神经元胞浆、神经胶质细胞中的胞浆内;PDXK和UCHL-1在神经元的免疫阳性细胞计数呈下降趋势,与Sham组比较,差异有统计学意义(P0.05)。WB结果显示脊髓损伤后PDXK和UCHL-1的蛋白含量表达趋势均是下降,差异有统计学意义(P0.05)。qRT-PCR结果显示PDXK与UCHL-1的mRNA表达水平在脊髓损伤后12h、1d、5d、14d都是下降的,与Sham组比较,差异有统计学意义(P0.05)。脊髓损伤后PDXK的mRNA表达量于术后12h开始下降,且在第5d下降达到最低值。UCHL-1 mRNA的表达水平持续下降非常明显,在第5d表达水平降到最低,第14d开始其表达明显稍有上调,但其表达水平明显低于Sham组。此外,在慢病毒介导的PDXK过表达大鼠脊髓损伤模型中,免疫组织化学方法结果显示,与Vector组比较,PDXK-ORF-LV组UCHL-1的免疫阳细胞计数数目增加,差异有统计学(P0.05);qRT-PCR结果显示,与Vector组比较,PDXK-ORF-LV组UCHL-1的mRNA表达明显升高,差异有统计学意义(P0.05)。结论1.PDXK与UCHL-1在脊髓损伤后表达下调;PDXK和UCHL-1位于脊髓前角的神经元和神经胶质细胞。随着BBB评分的升高,PDXK与UCHL-1的表达也有所提高,结果提示PDXK与UCHL-1可能影响脊髓损伤后运动功能的恢复。2.生物信息学分析结果提示PDXK与UCHL-1存在间接联系3.利用慢病毒介导PDXK过表达,结果提示在脊髓损伤后PDXK过表达使UCHL-1在脊髓组织中的表达上调,PDXK与UCHL-1的相互作用可能对大鼠脊髓损伤后的运动功能恢复有影响。
【关键词】：脊髓损伤 PDXK UCHL-1
【学位授予单位】：成都医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R651.2
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-11
• 前言11-14
• 1 实验材料14-19
• 1.1 主要实验仪器14-15
• 1.2 主要试剂15-16
• 1.3 试剂配制16-19
• 2 实验方法19-33
• 2.1 实验动物与分组19-20
• 2.2 脊髓损伤动物模型建立20-22
• 2.3 脊髓损伤动物模型神经行为学（BBB）评分22-24
• 2.4 石蜡切片制作24-26
• 2.5 石蜡切片Nissl染色26
• 2.6 石蜡切片免疫组织化学染色26-28
• 2.7 Western blotting分析28-30
• 2.8 qRT-PCR30-32
• 2.9 生物信息学分析32-33
• 2.10 统计学分析33
• 3 实验结果33-53
• 3.1 第一部分脊髓损伤后PDXK与UCHL-1 的表达对后肢运动功能的影响33-44
• 3.1.1 脊髓损伤后大鼠运动功能(BBB)评分下降33-34
• 3.1.2 Nissl染色观察脊髓损伤后的一般形态变化34-36
• 3.1.3 脊髓损伤后PDXK和UCHL-1 在脊髓前角灰质的定位表达及阳性细胞变化分析36-41
• 3.1.4 脊髓损伤后脊髓中PDXK和UCHL-1 的蛋白相对表达变化分析41-42
• 3.1.5 脊髓损伤后脊髓中PDXK和UCHL-1 的基因表达变化分析42-44
• 3.2 第二部分慢病毒介导的PDXK过表达调节脊髓损伤后UCHL-1 的表达44-53
• 3.2.1 生物信息学预测分析44-45
• 3.2.2 qRT-PCR鉴定慢病毒介导的PDXK过表达大鼠脊髓损伤模型45-46
• 3.2.3 慢病毒介导的PDXK过表达脊髓损伤后的Nissl染色46-48
• 3.2.4 慢病毒介导的PDXK过表达脊髓损伤后UCHL-1 在脊髓前角灰质的定位及阳性细胞变化分析48-51
• 3.2.5 慢病毒介导的PDXK过表达脊髓损伤后UCHL-1 的基因表达变化分析51-53
• 4 讨论53-59
• 4.1 大鼠脊髓损伤后一般形态变化53
• 4.2 PDXK和UCHL-1 对大鼠脊髓损伤后大鼠后肢运动功能恢复的影响53-55
• 4.3 PDXK与UCHL-1 的相互关系55-57
• 4.4 PDXK过表达上调脊髓损伤后UCHL-1 的表达57-59
• 5 结论59-60
• 参考文献60-65
• 文献综述65-73
• 参考文献70-73
• 附录一览表73-75
• 攻读硕士学位期间的研究成果75-76
• 致谢76

【参考文献】

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本文编号：986278