骨髓间充质干细胞培养上清液对大鼠角膜碱烧伤修复的实验研究

发布时间：2018-11-02 18:20

【摘要】：目的角膜碱烧伤是常见的、治疗较为棘手的角膜外伤,碱烧伤后不同的临床阶段,组织反应不同。急性期以炎症反应为特征,早期修复期以上皮细胞、基质细胞及细胞外基质的修复为主;目前临床上治疗碱烧伤多采用抗炎、抑制免疫反应、角膜移植等方法,但疗效不甚理想。骨髓间充质干细胞(Bone Mesenchymal Stem Cells BMSCs)是一种具有高度自我更新能力、多向分化潜能和免疫调节特性的成体干细胞。BMSCs能够合成分泌多种细胞因子,并可通过旁分泌效应促进受损细胞或组织修复。目前国内外研究已经证明BMSCs能够促进碱烧伤后角膜修复,但由其分泌的细胞因子的治疗作用,尚待进一步研究证明。本课题通过建立大鼠角膜碱烧伤模型,探讨骨髓间充质干细胞培养上清液(Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium MSC-CM)在碱烧伤后角膜上皮愈合、角膜混浊程度、组织炎症反应、基质纤维化、细胞增殖和凋亡中的作用。方法1.建立大鼠角膜碱烧伤模型:将直径4mm的单层滤纸片在1mol/L NaOH溶液中浸泡后,贴附于角膜中央10秒,损伤后治疗组给予MSC-CM局部点眼,对照组给予磷酸盐缓冲液(Phosphate-Buffer Saline PBS)点眼,大鼠饲养周期为14天,比较不同时间点两组角膜修复情况;2.裂隙灯观察碱烧伤后大鼠眼表的变化情况:分别于碱烧伤后12小时、24小时、48小时、3天、5天、7天、10天、14天,观察角膜上皮愈合情况,并计算上皮缺损面积百分比(荧光素钠染色,钴蓝光下观察);分别于碱烧伤后48小时、3天、5天、7天、10天、14天,观察中央角膜混浊度,并根据Fantes评分系统进行评分;3.组织病理学检查:分别于碱烧伤后12小时、24小时、48小时、3天、7天、14天,通过HE染色观察损伤后角膜组织形态学改变及炎症细胞浸润情况;分别于碱烧伤后24小时、48小时、3天、7天、14天,通过免疫组织化学染色,观察碱烧伤后大鼠角膜细胞增殖(PCNA)、基质纤维化(α-SMA)及细胞凋亡(Caspase-3)情况,并对阳性细胞进行计数;4.实时定量-聚合酶链锁反应(RT-PCR):分别于碱烧伤后12小时、24小时、48小时、3天、7天、14天,通过RT-PCR检测不同时间点炎症因子(TNF-α、IL-6、IL-10)、基质纤维化因子(α-SMA、Collage-Ⅲ、Collage-Ⅰ)、细胞增殖因子(PCNA)、细胞凋亡因子(Bax、Bcl_2、Caspase-3)的基因表达情况。结果1.碱烧伤后24小时、48小时、3天、5天、7天,MSC-CM治疗组角膜上皮缺损面积百分比小于PBS对照组,差异具有统计学意义(P0.05),MSC-CM治疗组角膜上皮于损伤后第7天完全愈合,PBS对照组角膜上皮于损伤后第10天完全愈合;碱烧伤后48小时、3天、5天、7天、10天,两组角膜混浊度评分比较,差异没有统计学意义,MSC-CM治疗组于损伤后第10天角膜完全透明,PBS对照组于损伤后第14天角膜完全透明;2. HE染色结果:碱烧伤后24小时、48小时、3天、7天,MSC-CM治疗组角膜上皮细胞层数,基质水肿程度,胶原纤维排列规整程度均优于PBS对照组,基质炎症细胞计数均少于PBS对照组,差异具有统计学意义(P0.01);3.免疫组织化学染色结果:碱烧伤后24小时、48小时、3天、5天、7天,PCNA阳性细胞计数MSC-CM治疗组均多于PBS对照组,差异具有统计学意义(P0.05);碱烧伤后24小时、48小时、3天、5天、7天、14天,α-SMA阳性细胞计数MSC-CM治疗组均少于PBS对照组,差异具有统计学意义(P0.05);碱烧伤后4小时、48小时、3天、5天、7天,Caspase-3阳性细胞计数MSC-CM治疗组均少于PBS对照组,差异具有统计学意义(P0.05);4. RT-PCR结果:碱烧伤后12小时、24小时、48小时、3天、7天,MSC-CM治疗组 TNF-α (P0.01)、IL-6 (P0.05)、α-SMA (P0.001)、Collage-Ⅲ(P0.01)、Bax (P0.01)、Caspase-3 (P0. 001)基因表达水平低于 PBS对照组,IL-10 (P0.05)、PCNA (P0.001)、Collagen-Ⅰ (P0.001)、Bcl_2(P0.01)基因表达水平高于PBS对照组,差异具有统计学意义。碱烧伤后第14天,MSC-CM治疗组TNF-α、Bax、Caspase-3、Bc12基因表达水平与PBS对照组比较,差异没有统计学意义;IL-6 (P0.05)、α-SMA (P0.001)、Collage-111 (P0.01)基因表达水平仍低于 PBS 对照组,IL-10 (P0.05)、PCNA (P0.001)、Collagen-Ⅰ (P0.001)基因表达水平仍高于PBS对照组,差异具有统计学意义。结论1. MSC-CM能够促进碱烧伤后角膜上皮修复,加快上皮愈合速度;2. MSC-CM能抑制碱烧伤后角膜组织的炎症反应,这可能与其能够抑制炎症因子TNF-α和IL-6基因表达,同时促进抗炎因子IL-10基因表达有关;3. MSC-CM能抑制碱烧伤后角膜基质纤维化,这可能与其能够抑制α-SMA和Collagen-Ⅲ基因和蛋白表达,同时促进Collagen-Ⅰ基因表达有关;4. MSC-CM能够抑制碱烧伤后角膜细胞凋亡,这可能与其能够促进凋亡抑制基因Bc12基因表达,并抑制凋亡诱导基因Bax、Caspase-3基因/蛋白表达有关。
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【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R779.1

【参考文献】