hiPSC来源的视网膜细胞对变性视网膜的作用研究

发布时间：2019-01-27 07:21

【摘要】：第一部hi PSCs诱导分化为视网膜祖细胞初探目的:探讨人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hi PSCs)高效分化为视网膜祖细胞(retinal progenitor cells,RPCs)(hi PSC-RPC)方法,为将来治疗视网膜变性疾病提供种子细胞。方法:细胞免疫荧光染色法对hi PSCs特异标记物Oct4、SSEA4、Sox2、Nanog和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AP)进行hi PSCs鉴定。在hi PSCs培养基中添加分化诱导剂(Dkk-1、Noggin、Lefty A和IGF-1)诱导分化为hi PSC-RPC。分化后的细胞分别用q PCR、免疫荧光染色和免疫蛋白印迹方法鉴定其标志性基因和蛋白(Pax6、Lhx2、Chx10和Nestin)的表达。结果:hi PSCs标记物Oct4、SSEA4、Sox2、Nanog和AP阳性表达。诱导定向分化后的hi PSC-RPC阳性表达Pax6、Lhx2、Chx10基因,而Oct4基因表达降低。通过免疫荧光染色鉴定RPCs阳性表达眼转录因子(Lhx2、Pax6)和RPCs的特异性标记物(Chx10、Nestin)。免疫蛋白印迹分析显示hi PSCs分化后Oct4蛋白表达降低,Lhx2蛋白表达升高。与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:hi PSCs在特定的诱导因子作用下可分化为RPCs。第二部分hi PSC-RPE细胞对变性视网膜的保护研究目的:视网膜色素变性是以感光细胞进行不可逆变性死亡为特征的遗传致盲性眼疾病。细胞移植治疗是目前实验研究治疗视网膜变性疾病的主要方法之一。hi PSCs源性的视网膜色素上皮细胞(retinal pigmented epithelium,RPE)(hi PSCRPE)为致盲性视网膜变性疾病的治疗提供种子细胞。本论文探究hi PSC-RPE细胞在体外对神经视网膜细胞作用以及hi PSC-RPE细胞视网膜下腔移植到视网膜色素变性模型rd10小鼠的影响作用。方法:1.hi PSCs培养液中添加特定的小分子[IGF-1、Noggin、DKK-1、Nicotinamide(NIC)、b FGF、Activin A和SU5402]进行循序定向诱导分化为RPE。细胞免疫荧光染色法鉴定对分化成hi PSC-RPE细胞。2.Tranwell小室共培养系统研究hi PSC-RPE细胞对鼠神经节细胞(mouse retina ganglion cell,m RGC)的增殖和凋亡影响。3.TUNEL染色观察rd10小鼠视网膜组织片与hi PSC-RPE培养1天后凋亡的感光细胞。4.球形培养PKH26标记的hi PSC-RPE细胞3天后,用胰酶消化成单散细胞,接着将hi PSC-RPE(1x104/eye)细胞移植到出生后12天(postnatal day12,P12)的rd10小鼠视网膜下腔。5.视网膜切片观察移植的细胞是否存活,并用酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)探测hi PSC-RPE细胞移植后rd10小鼠眼内分泌神经营养因子水平。6.免疫组织化学、TUNEL检测和免疫蛋白印迹方法分析移植hi PSC-RPE细胞对rd10小鼠视网膜内环境的影响。7.视网膜电图(electroretinography,ERG)和视网膜外核层(outer nuclear layer,ONL)厚度分析移植hi PSC-RPE细胞对rd10视网膜的结构和功能。结果:1.hi PSCs通过循序定向诱导20天后可分化hi PSC-RPE,hi PSC-RPE细胞通过细胞免疫荧光染色检测阳性表达(RPE-65、CRALB、Mitf、Otx2和Tyrosinase)RPE标志性蛋白。2.分别用CCK-8法检测和流式细胞仪检测发现m RGC与hi PSC-RPE共培养后可促进m RGC增殖和降低凋亡,与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。3.TUNEL染色标记发现与hi PSC-RPE细胞培养可以减少rd10视网膜组织片细胞的凋亡,差异有统计学意义(P0.05)。4.通过β-半乳糖苷酶(β-Gal)的衰老测试及钙黄绿素和Eth D-III双染色测试球形培养后的hi PSC-RPE细胞可以维持较年轻状态和较高的活力。5.通过视网膜组织切片染色结果发现移植2周后的hi PSC-RPE细胞在rd10小鼠视网膜内存活。ELISA检测hi PSCRPE细胞移植后rd10眼内含1.4ug/ml人源色素上皮衍生因子。6.免疫组织化学方法分析视网膜下腔移植hi PSC-RPE细胞抑制rd10视网膜小胶质细胞的激活(CD68)。蛋白免疫印迹结果显示hi PSC-RPE治疗的rd10可减少视网膜的凋亡蛋白因子(Bax)。TUNEL检测分析移植hi PSC-RPE细胞可以减少rd10感光细胞的死亡。与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)7.视网膜组织切片和DAPI染色观察移植hi PSC-RPE细胞rd10外核层的衰退可以延缓。根据rd10小鼠在暗适应和明适应的ERG反应,hi PSC-RPE移植的视网膜变性rd10小鼠可以提高视力。与对照组比较差异有统计学意义(P0.05)。结论:在我们研究中,hi PSCs可诱导分化成RPE,hi PSC-RPE移植到rd10视网膜下腔,移植细胞可以存活并且抑制小胶质细胞活动,减少相关凋亡因子,提高改善变性视网膜结构和功能。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：暨南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R774.1

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 陈鹏;视网膜疾病基因治疗的现状[J];国外医学.眼科学分册;2001年04期

2 ;视网膜疾病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2001年05期

3 邹红,黎蕾;变性性视网膜劈裂[J];国外医学(眼科学分册);2004年06期

4 ;视网膜疾病[J];国外科技资料目录.医药卫生;1997年06期

5 ;视网膜疾病[J];国外科技资料目录.医药卫生;1997年08期

6 ;视网膜疾病[J];国外科技资料目录.医药卫生;1998年12期

7 邱观婷,唐仕波;视网膜发育发生学的研究进展[J];国外医学.眼科学分册;2000年04期

8 赵平,张振宇;视网膜图像分析[J];眼科新进展;2000年01期

9 ;视网膜疾病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2001年04期

10 ;视网膜疾病[J];国外科技资料目录.医药卫生;2001年12期

相关会议论文 前10条

1 彭承琳;王星;孙世军;张思杰;;基于电刺激的视网膜下层修复方法的研究进展[A];中国仪器仪表学会2005年学术年会医疗仪器学术会议暨中国仪器仪表学会医疗仪器分会第三届第二次理事会论文汇编[C];2005年

2 周晓芳;徐国兴;;干细胞应用于治疗视网膜疾病的研究进展[A];第十届全国中西医结合眼科学术会议暨第五届海峡眼科学术交流会论文汇编[C];2011年

3 张作明;;视网膜疾病模式动物资源及其应用[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

4 章淑华;王育良;刘彦;;视网膜断层扫描仪对正常人视网膜神经纤维层厚度的测定[A];第三次全国中医、中西医结合眼科学术交流会论文汇编[C];2003年

5 宋宗明;潘琪琦;;无免疫缺陷疾病的巨细胞病毒性视网膜炎[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

6 辛瑞;;中西医结合治疗糖尿病性视网膜病变[A];甘肃省中医药学会2010年会员代表大会暨学术年会论文汇编[C];2010年

7 赵培泉;许宇;祝肇荣;;高速高分辨率的三维OCT-1000在视网膜疾病中的应用[A];中国眼底病论坛·全国眼底病专题学术研讨会论文汇编[C];2008年

8 解正高;吴星伟;邱庆华;宫媛媛;宋毅;顾青;李彩红;;促红细胞生成素与促红细胞生成素受体在大鼠脱离视网膜中的表达[A];中华医学会第十二届全国眼科学术大会论文汇编[C];2007年

9 于丹;崔浩;;中药丹参治疗兔眼医源性视网膜光损伤后的组织学研究[A];中华中医药学会第五次眼科学术交流会论文汇编[C];2006年

10 王萧;胡世兴;林少春;郭学军;邹移海;;光明液对视网膜光损害模型大鼠的疗效观察[A];中国实验动物学会第七届学术年会论文集[C];2006年

相关重要报纸文章 前6条

1 新华;视网膜自我修复研究有突破[N];福建科技报;2007年

2 新讯;视网膜自我修复研究有突破[N];医药经济报;2007年

3 玉淑 编译;“ＯＴＸ２”基因控制视网膜视细胞生长[N];大众科技报;2003年

4 闻声;英国：试验视网膜疾病基因疗法[N];中国医药报;2007年

5 保健时报实习记者 沈娜;让我们的双眸明亮依然[N];保健时报;2013年

6 英文化;微型机器医生执行重大医疗任务[N];科技日报;2004年

相关博士学位论文 前10条

1 朱颖;糖尿病视网膜病变患者全视网膜光凝后脉络膜厚度变化及视力预后的相关分析[D];复旦大学;2014年

2 范毅超;Exendin-4对GK大鼠早期糖尿病性视网膜病变保护机制的研究[D];复旦大学;2013年

3 王鑫;大鼠视网膜Mǖller细胞在机械牵张下基因变化的研究[D];复旦大学;2014年

4 曲泽澎;大鼠胚胎干细胞向视网膜祖细胞分化及在动物模型中移植的研究[D];上海交通大学;2015年

5 宋清露;OCT在小鼠眼底检查中的应用与OCT图像计算机自动化分割测量的研究[D];南京医科大学;2016年

6 范姗慧;谱域光学相干层析成像的深度拓展及其在眼调节研究中的应用[D];上海交通大学;2015年

7 邢茜;激肽释放酶结合蛋白抑制高糖诱导的人视网膜毛细血管内皮细胞增殖作用的研究[D];苏州大学;2016年

8 唐永萍;Liver X receptorβ对小鼠视网膜发育和视觉功能的影响及机制研究[D];第三军医大学;2013年

9 陶醉;大鼠视网膜色素变性对视网膜内层神经元和胶质细胞影响的研究[D];第三军医大学;2014年

10 王陆飞;骨髓间充质干细胞向视网膜样结构诱导分化的体外和体内研究[D];吉林大学;2004年

相关硕士学位论文 前10条

1 朱德良;hiPSC来源的视网膜细胞对变性视网膜的作用研究[D];暨南大学;2017年

2 林聪;干细胞源性视泡样结构电镜观察及组织工程化视网膜构建初探[D];复旦大学;2013年

3 董蒙;玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞对糖尿病大鼠血视网膜屏障保护作用的实验研究[D];天津医科大学;2015年

4 韩冰;芬戈莫德对光损伤大鼠视网膜光感受器细胞及视网膜小胶质细胞的影响[D];重庆医科大学;2015年

5 林云志;低强度白光照射对小鼠视网膜的影响[D];南京医科大学;2014年

6 戴慧;中药复方PRD对OLETF大鼠视网膜自杀相关因子和半胱天冬酶-8表达的影响[D];承德医学院;2016年

7 雷春燕;肝脏X受体激动剂干预β淀粉样蛋白诱导的视网膜炎症反应的作用及机制[D];重庆医科大学;2016年

8 王静;糖尿病大鼠视网膜中BIP、HIF-1α和VEGF的表达[D];上海交通大学;2015年

9 李丹;基于连续最大流算法眼底OCT图像视网膜层分割方法研究[D];吉林大学;2016年

10 许筱媛;SIRT1对高糖培养的RPE细胞及糖尿病大鼠视网膜氧化损伤的影响[D];福建医科大学;2016年

，

本文编号：2416041