大鼠羊膜上皮细胞胶原海绵复合体的构建及其对受损视神经的作用

发布时间：2019-07-19 05:33

【摘要】：目的：许多眼科疾病和外伤，如青光眼、视神经缺血、顿挫伤、视神经管骨折等，都可以使视网膜节细胞（retinal ganglioncells, RGCs）不可逆性凋亡，最终导致视觉功能障碍。目前对于此类疾患仍无有效的治疗方法。视神经和视网膜作为中枢神经系统（central nervous system, CNS）在颅外的延伸，在动物手术位置上具有优越性，因而视神经损伤模型又常被用来模拟CNS的损伤。因此，本研究从组织工程的角度，构建大鼠羊膜上皮细胞(amniotic epithelial cells, AECs)与胶原海绵复合体，将其移入大鼠视神经损伤模型中，探讨其对损伤视神经及CNS的作用。方法： 1)取妊娠晚期的SD大鼠，用胰蛋白酶序贯消化法获得原代AECs，用免疫细胞化学方法检测AECs是否表达CK19、COX10及Nestin，用PKH26标记第3代AECs。 2)构建AECs与胶原海绵复合体，在荧光显微镜下观察复合体内AECs的存活。 3)将SD大鼠随机分为4组：正常组、单纯损伤组、空支架组和复合体组。单纯损伤组：在左眼视乳头后约2mm处用1mm注射器针头切开视神经外膜，完全吸除长约0.5mm的视神经，保持神经外膜的主要血管不受损伤；空支架组：在视神经的吸断处移植相应大小的胶原海绵；复合体组：在视神经的吸断处注入10μl密度为1×107个/ml的细胞悬液后，移植相应大小的复合体。 4)观察胶原海绵和复合体与视神经的组织相容性。术后第7天计数复合体内的AECs并检测其Nestin的表达。术后第28天，观察AECs与再生轴突的关系。 5)检测复合体移植对RGCs的作用：HE染色、尼氏染色、CTB-FITC顺行示踪和免疫组织化学法检测MAP-2在视网膜中的表达。 6)检测复合体移植对视神经的作用：HE染色、CTB-FITC顺行示踪和免疫组织化学法检测GFAP、GAP-43在视神经中的表达。 7)用Panorama Maker5软件拼接图片，用Photoshop CS3软件计数和测量长度，用Image Pro Plus6.0软件测量面积，用SPSS18.0软件进行统计分析。结果： 1)体外培养的AECs可以表达CK19、COX10和Nestin，AECs具有干细胞特性和向神经类细胞分化的潜能。 2)复合体内的AECs生物活性好，细胞密度为604.3个/mm2，48%的AECs表达Nestin，复合体内部分细胞仍具有向神经类细胞分化的潜能。 3)术后第28天至第56天，视神经内基本不见胶原海绵的空间物理结构，胶原海绵和复合体与视神经的组织相容性好。术后7天复合体内存活的AECs密度为424.7个/mm2，17%的AECs表达Nestin。复合体内的AECs至少到第28天还有存活，并可向损伤区两侧迁移。复合体内的AECs与再生轴突伴行。复合体内AECs存活率较高，部分AECs具有向神经类细胞分化的潜能，复合体利于改善视神经再生的微环境。 4)视网膜的尼氏染色显示：术后第28天，空支架组节细胞层细胞直径≥12μm的细胞数量和细胞总数多于单纯损伤组，复合体组又多于空支架组；细胞直径＜12μm的细胞数量，空支架组和复合体组多于单纯损伤组。复合体可增加视网膜内各类细胞的数量，特别是大细胞；胶原海绵的作用相对较小。 5）视网膜的HE染色显示：术后第28天和第56天，各实验组的节细胞层细胞数、内网层厚度和内核层厚度均比正常组少。节细胞层细胞数，术后第28天复合体组多于单纯损伤组和空支架组，术后第56天复合体组多于空支架组；内网层厚度和内核层厚度，术后第56天复合体组和空支架组均高于单纯损伤组。复合体比胶原海绵对节细胞层细胞数、内网层和内核层的增加作用更明显。 6）CTB-FITC示踪的RGCs胞体及其视网膜内轴突显示：术后第28天和第56天，各实验组视网膜中央、中间和外周的CTB-FITC阳性区域面积比例均低于正常组。中央：术后第28天复合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低；术后第56天复合体组和空支架组均高于单纯损伤组。中间：术后第28天各实验组无明显差异，术后第56天复合体组高于空支架组和单纯损伤组。外周：术后第28天各实验组无明显差异；术后第56天复合体组高于单纯损伤组。复合体和胶原海绵可增加视网膜内存活的RGCs及其轴突，前者效果更为显著。 7）CTB-FITC示踪的视神经显示：术后第28天和第56天，近侧段和损伤区的CTB-FITC阳性区域面积比例，复合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低。复合体比胶原海绵更能增加再生轴突的数量，复合体移植后可促进再生的轴突穿过损伤区到远侧段815μm处。 8）免疫组织化学染色显示：术后第28天，各实验组视网膜每个视野内MAP-2阳性物质积分光密度均低于正常组，复合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低，复合体增加视网膜内神经元存活的作用强于胶原海绵。术后第28天和第56天损伤区GFAP阳性物质平均积分光密度，单纯损伤组复合体组最高，空支架组次之，复合体组最低，复合体使损伤区GFAP表达减少的作用大于胶原海绵。术后第28天组损伤区GAP-43阳性物质平均积分光密度，复合体组最高，空支架组次之，单纯损伤组最低，复合体使损伤区GAP-43表达增加的作用大于胶原海绵。结论： 1)胶原海绵的空间物理结构有利于AECs粘附和生存。 2) AECs胶原海绵复合体移植可发挥AECs与胶原海绵的协同作用，改善视神经轴突再生的局部微环境，增加RGCs的存活量，促进视神经轴突的再生。 3) AECs胶原海绵复合体用于修复视神经损伤的方法是可行的。
文内图片：术后眼和视神经模式图

图片说明：原海绵复合体内细胞的计数个复合体的冰冻切片(厚度 5 μm)，PBS 洗 3×000，0.4% Triton X-100 稀释），室温 5 min。5 min，碳酸甘油荧光封片剂封片，荧光显微拍照，用 Image Pro Plus 6.0 软件计数细胞。每 mm2的细胞个数=细胞总数÷（图片实际海绵复合体内细胞的形态观察--HE 染色切片，自来水冲洗 5 min。苏木精染色室温 7 m75%酒精分色，85%、95%和 100%酒精梯度模型的制作和分组
文内图片：视网膜铺片模式图

图片说明：视网膜铺片注固定后取眼球，4%多聚甲醛4 后固定2.5 h。沿眼角膜巩膜缘和玻璃体，，以留存的眼上直肌为标志，保留上、下、鼻、颞四个央呈十字花样剪开视杯，分离视网膜，用 0.5%明胶将其铺在载视网膜尼氏染色和细胞计数 28 天的视网膜铺片，自然晾干，自来水洗 5 min，甲苯胺蓝室温 min，梯度脱水，二甲苯透明后封片观察。神经乳头后在留取的四个象限中，每个象限取 3 个视野（40×膜的中央、中间和外周（图 2）。在软件 Photoshop CS3 的辅助m的细胞和＜12 μm的细胞。进一步计算每个视野细胞直径≥12平均数及细胞总数。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：R779.1

【参考文献】