LXRs激活对RD1小鼠视网膜变性微环境的作用及其对植入神经干细胞的保护作用

发布时间：2019-07-22 14:16

【摘要】：研究背景和目的视网膜变性(retinal degeneration,RD),包括视网膜色素变性(retinitis pigmentosa,RP),是一类以进行性光感受器丢失为特征的遗传性眼病[1,2],是发达国家最常见的致盲性眼病之一,目前尚无有效治疗手段。近期研究发现,视网膜小胶质细胞活化介导的免疫炎症反应[3-5]和Müller细胞的胶质活化[6,7]是变性视网膜主要的微环境改变,对视网膜变性的进展发挥了关键作用,可望成为治疗的靶点[8]。干细胞移植是目前治疗RD等致盲性眼病最具前景的手段,植入细胞的营养效应和免疫调节作用被认为是干细胞在短期发挥治疗作用的重要机制,而细胞替代效应(cell replacement)被认为是其长期作用的机制[9]。众所周知,移植细胞的命运受其所在微环境的影响。近期研究发现,抑制变性视网膜中的免疫炎症反[10]应或Müller细胞活化产生的胶质瘢痕[11],能够提高移植细胞的存活及功能整合,有利于长期的细胞替代效应。肝脏X受体(liver X receptors,LXRs)是核受体超家族成员之一,在调节脂质、葡萄糖代谢方面起重要作用[12,13]。近期研究报道LXRs对神经退行性病变中的免疫炎症反应同样起重要调节作用[13],并与胶质细胞活化密切相关[14]。Lei等发现LXRs受体激动剂T0901317能够保护N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导的视网膜损伤以及抑制实验性葡萄膜炎引起的眼部炎症[15,16]。LXRs激活对变性视网膜有何作用,对变性视网膜的微环境有何影响,这种作用对植入的干细胞命运和治疗效果有何影响,目前未见相关文献报道。本研究主要探索LXRs受体激动剂T0901317介导的LXRs激活对视网膜变性小鼠模型Rd1视网膜中的Müller细胞的胶质化和小胶质细胞的免疫炎症反应有何调节作用,这种作用能否延缓Rd1小鼠视网膜感光细胞的变性进程、挽救视功能及对植入的小鼠神经干细胞C17.2的命运转归和治疗效果有何影响。初步探讨LXRs激活对变性微环境以及植入干细胞的作用及机制。方法:第一部分:LXRs激活对Rd1小鼠变性视网膜的影响1.取出生后7天(P7)Rd1小鼠,同天龄C57/BL6小鼠作为对照。连续7天给予LXRs激动剂T0901317或2%二甲亚枫(DMSO)腹腔注射,于P15取小鼠视网膜标本,运用RT-qPRC检测视网膜中LXRs的激活情况。2.取P15小鼠视网膜标本,运用免疫组化以及Western-blot技术,对比LXRs激活与否对小鼠视网膜中光感受细胞凋亡、Müller细胞胶质化和小胶质细胞激活的影响。3.运用视网膜电图(ERG)技术,检测P15小鼠视网膜功能,观察LXRs激活对RD1小鼠视网膜视功能的影响。第二部分:LXRs激活影响Rd1小鼠视网膜变性的机制1.取T090处理7天后P15的变性RD1小鼠视网膜RNA标本,RT-q PCR检测LXRs激活后白介素6(IL-6)、环氧合酶2(COX-2)、一氧化氮合酶(i NOS)等炎症相关基因表达的变化。2.基因芯片技术检测T0介导LXRs激活后Rd1变性小鼠视网膜总RNA表达谱变化,RT-qPCR验证相关结果。第三部分:LXRs激活对神经干细胞生物学特性及在Rd1小鼠视网膜中的影响1.不同浓度的T0处理体外培养的大鼠神经干细胞系L2.3 48h后,观察神经干细胞形成克隆球的大小,并用流式细胞术检测凋亡的情况。2.选取天龄为P11的Rd1小鼠,连续3天给予T0(50mg/kg)腹腔注射,于P14给予小鼠视玻璃体腔内移植小鼠神经干细胞系GFP-C17.2,1周后取小鼠视网膜标本,免疫组化观察小鼠视网膜感光细胞、移植细胞的情况。3.ERG检测移植后1周变性小鼠视功能,观察联合T0与干细胞移植后Rd1小鼠视功能改变情况。结果:第一部分:LXRs激活对Rd1小鼠变性视网膜的影响1.RT-PCR结果显示腹腔连续注射T0,可以增加小鼠视网膜中的LXRβ以及LXRs下游基因ABCA1、ABCG1等表达,但LXRα表达降低,提示T0能够且主要激活小鼠视网膜中LXRβ亚型。2.T0介导的LXRs激活可显著抑制Müller细胞GFAP的表达以及显著减少活化小胶质细胞的数量,明显减少Rd1小鼠视网膜感光细胞的凋亡数量,延缓Rd1小鼠视网膜变性过程中光感受细胞的丢失,提示激活LXRs可通过抑制视网膜胶质细胞的活化而延缓变性。3.T0介导的LXRs激活可以部分挽救Rd1小鼠变性过程中视功能的损害,ERG表现为暗适应下b波幅值的显著升高。第二部分:LXRs激活影响Rd1小鼠视网膜的机制1.RT-qPCR结果显示,激活LXRs可显著抑制多种炎症相关基因如IL-6、COX-2、i NOS等的表达,提示LXRs参与了变性视网膜中炎症反应的调控。2.表达谱基因芯片检测结果提示LXRs激活可能通过JAK3-STAT途径抑制变性视网膜中的Müller细胞胶质化和小胶质胶质活化,改善变性视网膜的微环境从而延缓视网膜变性进程。第三部分:LXRs激活对神经干细胞生物学特性及在Rd1小鼠视网膜中的影响1.LXRs激活能够增加L2.3的增殖,对其凋亡没有影响。2.移植入T0处理的Rd1小鼠玻璃体腔的神经干细胞C17.2存活率较对照组高,且其视网膜外核层厚度厚于对照组。3.T0预处理联合C17.2移植对天龄P21的Rd1小鼠视功能的未见明显的保护作用。结论:1.T0通过激活Rd1小鼠变性视网膜中的LXRβ受体,进而调节JAK3-STAT信号通路而抑制Müller细胞、小胶质细胞的过度活化所介导的胶质化和免疫炎症反应,从而减少Rd1小鼠视网膜中感光细胞的凋亡,挽救Rd1小鼠部分视功能。2.T0预处理能够改善Rd1小鼠视网膜变性微环境,提高移植入Rd1小鼠视网膜的小鼠神经干细胞C17.2的存活率。T0预处理与C17.2移植对Rd1小鼠视网膜外核层的保护具有协同作用。
【图文】：

图 2-1 小鼠给药及标本取样流程示意图（3）RT-qPCR 检测：通过 RT-qPCR 在 mRNA 水平检测 Rd1 及 C57 小鼠视网膜经 T0901317 处α、LXRβ 以及其下游基因 ABCA1、ABCG1 表达的变化。1）配制 RT-qPCR 常用试剂① 50×电泳缓冲液 TAE：Tris 碱，242g；EDTA，，100ml（0.5mol/L PH＝8酸，57.1ml；以蒸馏水配至 1000ml；去离子水 50 稀释使用。② 1‰ DEPC 水配制 75%乙醇，4℃备用。2）提取视网膜总 RNA① 腹腔注射戊巴比妥钠麻药后断颈处死小鼠，显微镜下提取小鼠视网膜，每 8 眼，置于冰上，加入 1ml Trizol 试剂，裂解 5min。② 加入 0.2ml 氯仿后振荡混匀至肉眼不见视网膜组织；4℃，15000g，离心 5③ 提取上层水相 400μl，加入等体积异丙醇后混匀；4℃，15000g，离心 2

图 2-2 T0 处理后 C57 和 Rd1 小鼠视网膜 LXRs 基因表达的变化经 T0 处理 7 天后 C57 小鼠视网膜 LXRα mRNA 表达水平几乎无变化，LXRNA 表达水平明显上升，差异有统计学意义。Rd1 经 T0 处理后小鼠与对照组相比视网膜 LXRα 基因表达水平降低，LXRβ mRNA 表达水平明显升高，差异均有统意义。（t 检验，*P＜0.05，n=6）表 2-3 经 T0 处理后小鼠视网膜 LXRs 靶基因表达水平统计数据ABCA1 ABCG1C57 对照组 1.00±0.00 1.00±0.00C57 处理组 6.98±0.08*** 2.85±0.26*Rd1 对照组 5.36±0.34 1.97±0.39Rd1 处理组 13.70±2.37** 3.23±0.20*
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R774.1

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本文编号：2517669